菌種選育理論和技術(shù)_第1頁
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文檔簡介

1、第二章 工業(yè)微生物菌種選育,1.微生物分離2.自然選育3.誘變育種4.雜交育種5.原生質(zhì)體技術(shù)6.分子育種,,菌種選育,第一節(jié) 微生物分離,1.1 菌種分離的一般過程,土樣的采取,→ 預(yù)處理,→ 培養(yǎng),→ 菌落的選擇,→ 產(chǎn)品的鑒定,如何使樣品中所含微生物的可能性大,如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn),目的:高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物,問題:,1.2 采樣時要注意的問題,氣候、水分、空氣,來源要廣,結(jié)合產(chǎn)品的特點,

2、標(biāo)簽:地點、時間、氣候等,富集的三種方案:,定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集 的條件,進(jìn)行培養(yǎng)。,1.3 目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的:,讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢,使篩選變得可能。,當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時,則可設(shè)計在一個分 類學(xué)中考慮。,不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息,這 時只能通過隨機分離的辦法。,定向培養(yǎng)的富集方法,1、底物,2、pH條件,3、培養(yǎng)時間,4、培養(yǎng)溫度,等一切能提高目的微

3、生物相對生長速度的手段,培養(yǎng)(固體、液體;分批連續(xù))后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。,定向培養(yǎng)的方法,物理方法:加熱、膜過濾等,但主要是通過培養(yǎng)的方法,1.4 菌落的選出,從產(chǎn)物角度出發(fā),在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基,利用簡單、快速的鑒定方法,如抗生素,從形態(tài)的角度,菌落的外觀形態(tài),是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長,從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。,例:醛肟水解酶的篩選,--Journal of

4、biotechnology 94(2002), 65-72,培養(yǎng)基中含0.05% of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物,補充新鮮培養(yǎng)基,不斷分析樣品,2-3個月后Z-PAOx降低后,稀釋分離單菌落,,,1.5 目的微生物富集方法的研究進(jìn)展,分子生物學(xué)的實驗手段,在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物 的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析,基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等,目前土壤中能夠培養(yǎng)

5、的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的 多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。,In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of `nonculturabl

6、e' organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.,第二節(jié) 自然選育,2.1 定義

7、 利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理,通過分離,篩選排除衰退型菌株,從中選擇維持原有水平的菌株,又稱自然分離。,二、菌種退化的原因自發(fā)突變;異核體的存在;突變株不穩(wěn)定,,,,,,移種,搖瓶初篩,,2.2 自然選育流程圖,第三節(jié) 誘變育種,3.1 定義 將生物體暴露于物理、化學(xué)或生物誘變劑作用下,促使生物體發(fā)生突變、提高變異幅度,從而選出優(yōu)良菌種的過程。,,穩(wěn)定性試驗、菌種特性考察,

8、3.2 誘變育種流程圖,3.3 誘變劑,凡能提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱誘變劑。 3.3.1 物理誘變劑 紫外線、X射線、γ射線、快中子、離子束 UV:260nm,是堿基共軛體系的最高吸收峰 引起胸腺嘧啶二聚體的形成和胞嘧啶水合作用 生物學(xué)效應(yīng):DNA鏈的斷裂;DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián);核酸和蛋白的交聯(lián)。,實驗室:15W,253.7nm,燈管與樣品的距離30cm,劑量由時間(

9、30秒、 60秒、 90秒、 120秒)或能量(格爾)決定。 死亡率控制在70~90%。 誘變后注意要避光培養(yǎng)(因為光復(fù)活現(xiàn)象)。,3.3.2 化學(xué)誘變劑 烷化劑:如亞硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)、乙烯亞胺(EI)、氮芥 作用機制:使核酸的氮原子上烷基,從而使配對錯誤。,堿基類似物:5-氟尿嘧啶,5-溴尿嘧啶,2-氨基嘌呤,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,,移碼誘變劑:

10、丫啶橙、丫啶黃 引起堿基喪失或增加抗癌藥物:絲裂霉素、爭光霉素 抑制DNA復(fù)制3.3.3 生物誘變劑 噬菌體,轉(zhuǎn)座子,3.4 菌種誘變的方法,誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個部分。 3.4.1 出發(fā)菌種選擇原則: 選取純種作為出發(fā)菌株 選擇具有優(yōu)良性狀的菌株

11、 對誘變劑敏感的菌株,,處理單孢子(或單細(xì)胞)懸液:,芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢,放線菌,霉菌應(yīng)處理孢子,細(xì)菌指數(shù)期,放線菌、霉菌要稍加萌發(fā)后使用,出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸液,誘變劑的使用: 劑量以誘變劑濃度和處理時間來表示,合適劑量: 能擴大變異幅度又能促使 變異移向正變范圍的劑量,3.4.2 誘變處理,還可加誘變增強劑:如LiCl,充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng),兩種或多種誘變劑先后使用,同種誘變劑

12、重復(fù)使用,兩種或多種誘變劑同時使用,3.4.3 突變株的選擇,3.4.3.1 隨機篩選搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動化和篩選工具微型化,,,3.4.3.2 理性化篩選初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選①篩選營養(yǎng)缺陷型若分別篩選D、E高產(chǎn)菌株,根據(jù)下列代謝途徑,應(yīng):A B C D EA B C D,EF,篩選E缺陷型,篩選F缺陷型,

13、②篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株 篩選油酸缺陷型或甘油缺陷型,③篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 結(jié)構(gòu)類似物一方面與代謝物結(jié)構(gòu)相似,有相似的反饋調(diào)節(jié)作用;一方面不同于代謝物不具有正常的生理功能,使細(xì)胞死亡。 添加此類物質(zhì),大部分細(xì)胞缺少該種初級代謝物而死亡,生長下來的菌株對此結(jié)構(gòu)類似物不敏感,不受此反饋調(diào)節(jié)抑制。,HD:高絲氨酸脫氫酶,黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制,HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶,A

14、K:天冬氨酸激酶,結(jié)構(gòu)類似物抗性:Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV,營養(yǎng)缺陷型:如Thr缺陷型,黃色短桿菌F9-50的誘變譜系,Bervibacterium flavum As 1.495 (Ile-) lys.HCl 2.1 g/l,F6-16 (Ile -, Thr -) 20.8 g/l,F9-50 (leu -, Thr -, AEC

15、 r) 33.5 g/l,,,,,④利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變株 先選對產(chǎn)物敏感的菌株,再誘變處理得到恢復(fù)突變株(改變酶的調(diào)節(jié)位點,不受產(chǎn)物的反饋抑制)。,次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選①篩選營養(yǎng)缺陷型②篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株③篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株 磷酸鹽對許多抗生素的生物合成有抑制作用,④篩選去除碳源分解代謝突變株 能被菌快速利用的碳源在被代謝后

16、,對其他代謝途徑的酶有抑制作用,例葡萄糖效應(yīng)。 葡萄糖效應(yīng):培養(yǎng)基中同時含有葡萄糖和乳糖,微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖,出現(xiàn)兩次菌體生長旺盛時期,若加入乳糖酶誘導(dǎo)物,也不產(chǎn)生乳糖酶,而是在葡萄糖利用完后才產(chǎn)生。 方法:將菌在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基連續(xù)傳代。⑤篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 許多抗生素和氨基酸有共同的前體,⑥篩選二價

17、金屬離子抗性突變株 二價金屬離子可與產(chǎn)物或其中間體結(jié)合,抑制產(chǎn)物合成⑦篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對菌體的生長和抗生素的生物合成有抑制作用⑧篩選自身所產(chǎn)抗生素抗性突變株,第四節(jié) 雜交育種,4.1 定義 將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合或接合使遺傳物質(zhì)重新組合,從中分離和篩選具有新性狀的菌株。 4.2 舉例 一株大腸桿菌A-

18、B+Lac-SMrT1s 另一株大腸桿菌A+B-Lac+SMsT1r 混合培養(yǎng)后,長出少數(shù)菌落。,4.2.1 細(xì)菌雜交,在細(xì)菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多,主要是大腸桿菌,其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。 大腸桿菌中存著致育因子F,有F因子為F+,沒有F因子稱F-。整合狀態(tài)為Hfr。 F因子有明顯的感染性,大腸桿菌的接合,實質(zhì)上是F因

19、子的轉(zhuǎn)移,所以F+和Hfr稱供體菌,而F-稱受體菌。,4.2.2 酵母雜交育種技術(shù),酵母繁殖方式: 酵母為單細(xì)胞型真菌,一般以出芽方式生殖,在通常情況下,繁殖體為雙倍體,但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo),可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。 單倍體細(xì)胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配,恢復(fù)為雙倍體;同一交配型細(xì)胞之間,則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配

20、。 在生活過程中,酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。,一般而言,雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期,將不同基因型和相對的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞,經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。,第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù),菌體經(jīng)溶菌酶處理后,去掉了細(xì)胞壁,露出球形且特別脆弱的原生質(zhì)體。它對滲透壓、振蕩、離心等十分敏感。 但由于原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)與生理活性均未發(fā)生改變,故在適宜的條件下,

21、可以再生出細(xì)胞壁進(jìn)行細(xì)胞分裂。,原生質(zhì)體制備和再生的過程,,培養(yǎng)菌絲(細(xì)胞),,,洗滌菌絲,,,溶菌酶處理菌絲,,形成原生質(zhì)體、離心,,用高滲溶液洗滌原生質(zhì)體,,,,,,原生質(zhì)體融合,,,,第六節(jié) 分子育種,6.1 提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1. 增加限速酶的基因拷貝數(shù)2. 增加正調(diào)節(jié)基因,去除負(fù)調(diào)節(jié)基因3. 增加抗性基因的拷貝數(shù),6.1.1 增加限速酶的基因拷貝數(shù),原理: Ea

22、 Eb Ec Ed A B C D E ( 代謝產(chǎn)物) 限速酶

23、 Rate-limiting enzyme (Bottleneck)例1: 起始原料 Ea Eb Ec ?-aminoadipic

24、 acid ACV三肽 異青霉素N 青霉素 L-cysteine L-valine Ea: ACV合成酶(限速酶) Eb:異青霉素N合成酶

25、 Ec:異青霉素N?;饷?,,,,,,,,,,,,例2. 頭孢菌素C生物合成的限速酶,在頭孢菌素C 的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中,人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中,除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外,在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素N。 問題:積累中間產(chǎn)物-青霉素N 原因:下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng) 解決:導(dǎo)入額外的擴環(huán)酶/羥化酶基因 結(jié)果:使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高 25-50%, 積累的青霉素N消失。,

26、,,,,,,6.1.2 增加正調(diào)節(jié)基因, 去除負(fù)調(diào)節(jié)基因,調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)促進(jìn)生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,負(fù)調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。,,去除負(fù)調(diào)節(jié)基因使結(jié)構(gòu)基因超量表達(dá),,6.1.3 增加抗性基因的拷貝數(shù),抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅。 其作用可通過三條途徑實現(xiàn):抗性基因產(chǎn)物(酶)將抗生素作用的底物加以修飾;將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾,使其失活; 將抗生素分

27、子排出細(xì)胞外。,例1. Davies J. 利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702 從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6’-N-氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6’的基因(aacA),該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下,可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6’乙?;?。將aacA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中, 結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量.,,,,,,,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化子- 鏈霉菌細(xì)胞 氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高,卡那霉素6’-乙酰轉(zhuǎn)移酶[AAC(6’)] 的作用,,例2.

28、 螺旋霉素抗性基因srmB 重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 S.ambofaciens(生二素鏈霉菌) 轉(zhuǎn)化子 使螺旋霉素產(chǎn)量提高。,,,,,,,6.2 改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分,鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物常常是一

29、組結(jié)構(gòu)相似的混合物。每個化合物稱為它的一個組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因為次級代謝產(chǎn)物的合成酶對底物的選擇性不強以及合成途徑中分支途徑的存在。 通過基因工程手段,滅活某分支途徑的酶,就可以去除該分支途徑的產(chǎn)物。此策略常用來去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無用組分,提高有用組分的含量。,只產(chǎn)Avermectin “2”組分基因工程菌的構(gòu)建,,,aveC 脫水酶,,,,阿維菌素“2”組分,阿維菌素“1”組分,,,,aveC基因在染色體上的位

30、置,,重組質(zhì)粒的構(gòu)建,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,pC04,,Bgl,,II,,,,p,pC05,,,圖,1,-,8,,質(zhì)粒,pC05,的構(gòu)建過程,,Fig,.,1,-,8,,The procedures in the,,construction of plasmid pC05,,,pC03,,,,,,,Ligase,,重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌,,,tsrR amR,tsrR amR,,

31、,,Gene replacement (基因置換),,,,,D,B,B,C am C,aveC,,,,,,,,aveC,am,,,tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC–,遺傳型的改變,,,,,B,am,,,,,,aveC,am,,,,,,aveC,,tsrR amR aveC–

32、 tsrS amR aveC –,傳幾代后,丟掉質(zhì)粒,,,,,,,基因工程菌AveC9,基因工程菌AveC-9發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析,,,,,,,,,,,,,,control,,,基因,工程,菌,AveC9,,,,,,B2a,,,A2a,,,B1a,,,A1a,,,B2a,,,A2a,,6.3 基因工程的簡要步驟,1. 目的基因的準(zhǔn)備2. 載體系統(tǒng)

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