生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏

1、生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏,主講人：韓北忠 劉 萍,帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置,第一節(jié) 菌種的分離簡介,一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。,二、分離思路,新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用

2、菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。,定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對(duì)性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫

3、度、最適pH值、提取工藝等。,三、新種分離與篩選的步驟,（一）采樣,1、采樣對(duì)象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。,,從自然界篩選,2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛

4、入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。,（二）增殖培養(yǎng),為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物

5、就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。,（三）培養(yǎng)分離,盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。,（四）篩 選,這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。,（五）毒性試驗(yàn),自然界的一些微生物是在一定條

6、件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。,第二節(jié) 培養(yǎng)分離,從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。 到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株

7、；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的。,一、成功的分離培養(yǎng)方法,(1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過程。,二、培養(yǎng)分離中要解決的問題,1、“分離什么和從哪里分離出?” 2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的

8、難易和費(fèi)用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。,三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn),1．羅列出所要分離的微生物類群；2．根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3．將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4．羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；,5．列出

9、生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6．根據(jù)上述1-5項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9．運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。,四、自然界中細(xì)菌的分離,(一)采樣和采集方法,為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代

10、表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。,采樣的注意事項(xiàng),1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的；,,5、

11、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時(shí)間不宜過長。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長,1．土樣采集方法,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是自土壤

12、中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。,2．植物體采集方法,在采集葉面時(shí)，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時(shí)，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時(shí)，一般與根際土樣一起保存。,

13、3．水樣采集方法,用于細(xì)菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測，或者4℃下貯存。,(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則,1、加入培養(yǎng)基中

14、的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。,3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1， 以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2

15、天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。,土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離,分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。,富集方法,運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。,土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.

16、1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細(xì)菌的分離：水樣通過0.22μm無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。,水中細(xì)菌分離的簡易富集技術(shù),在無菌的、用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣

17、中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。,次代培養(yǎng)及純化步驟,1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上

18、及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。4、將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。,五、放線菌的分離,(一)采樣及采集方法應(yīng)盡可能實(shí)行無菌操作。所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。樣本采集完后，應(yīng)及時(shí)處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時(shí)間不宜過長。,(二)生態(tài)學(xué)參數(shù),放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的

19、生態(tài)參數(shù)有溫度、pH、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢和底物濃度。,（三）培養(yǎng)基的組成原則,大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。,放線菌的分離,土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海

20、綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。,次代培養(yǎng)及純化,菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線

21、菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。,六、真菌分離,1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計(jì)數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷涉生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌

22、的分離。3、有時(shí)，真菌子實(shí)體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮。,4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效

23、地抑制細(xì)菌生長及菌落形成。,真菌的分離方法,土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。,七、生產(chǎn)選種,是在長年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變

24、更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。,第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針,工業(yè)菌種的育種： 是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加

25、新的性狀。,工業(yè)菌種育種的方法,誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組,育種過程,包括下列3個(gè)步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評(píng)價(jià)(包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。,選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素,(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))； (2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認(rèn)識(shí)的明了程度； (3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工

26、藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。,工業(yè)菌種改良方法,(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或

27、產(chǎn)品的耐受力。,,(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。,提高特定基因的表達(dá)水平,(1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)，可通過在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào)，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變。,改進(jìn)菌種的生長效率,提高菌株對(duì)底物的利用率方法： a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分; b. 由另

28、一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實(shí)現(xiàn)。 c. 賦予菌種對(duì)多種底物，特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費(fèi)用。,第四節(jié) 誘變育種,以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。,誘變,物理、化學(xué)或生物誘變方法,一、誘變劑和誘變處理,物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；

29、物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。,化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。,,2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)

30、的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對(duì)某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會(huì)過敏，這就更要當(dāng)心。,誘變劑的選擇,1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損

31、傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。,,3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。,二、誘變育種步驟,出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選,(一)出發(fā)菌株的選擇,1．自然界新分離的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。

32、2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。,5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性

33、，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。,(二)處理菌懸液的制備,這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。,(三)誘變處理,根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。,(四)中間培養(yǎng),由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，

34、需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個(gè)過程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。,,方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。,(五)分離和篩選,篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅

35、速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。,紫外線的誘變育種,紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長

36、為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。,被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個(gè)／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行

37、。,(二)操作步驟 1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個(gè)／ml左右，作為待處理菌懸液。,,3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下3

38、0cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。,4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7．挑取菌落進(jìn)行篩選。,亞硝基胍誘變曲霉菌,N—甲基—

39、N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。,(二)操作步驟 1．單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子

40、懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個(gè)／ml，此為待處理孢子懸液。 2．MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。,3．誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計(jì)數(shù)。 4．死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸

41、緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。 5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．,第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育,營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。,能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培

42、養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。,營養(yǎng)缺陷型的用途,營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。,篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟,誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜,一、誘變方法,物理誘變化學(xué)誘變,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變

43、處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長后會(huì)長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。,三、檢出缺陷型,原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良

44、好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法,1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。,(一)影印法,,4 ．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進(jìn)行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少

45、于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。,(二)點(diǎn)種法,也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。,(三)夾層法,先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上

46、一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。,四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定,驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。,生長譜測定的方法,將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個(gè)區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合

47、區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)?！獋€(gè)平皿測一個(gè)菌。,,以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個(gè)平皿上可測20株菌以上。,第六節(jié) 基因育種,基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞

48、間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個(gè)細(xì)胞的方法。,一個(gè)完整的基因克隆過程包括以下步驟,１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。,2.2基因重組,一、質(zhì)粒的特點(diǎn),1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需。2、每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不

49、同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià)、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于—條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。,質(zhì)粒載體,二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型,抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 在自

50、然條件下，許多質(zhì)粒可經(jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)。,三、質(zhì)粒DNA的提取方法,細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增；細(xì)菌的收獲和裂解；質(zhì)粒DNA的提取。,四、遺傳轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。,(二)操作步驟：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯

51、培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml 2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。,,4．當(dāng)培養(yǎng)物OD600在o.5～o.8左右時(shí)，開始收獲細(xì)胞(大約需2～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個(gè)冷離心管中棄去上清液。,7．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，再加0.9ml

52、CaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液．9．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。,,11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中．加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。,常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),1、自然系統(tǒng)2、

53、人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞）（1）二價(jià)陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca 2+（2）單價(jià)陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導(dǎo)（PEG/原生質(zhì)體）,重組DNA中常用的工具酶,包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.,限制性內(nèi)切酶,切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn)。常用限制性內(nèi)切酶種類及特性

54、,W. Arber,H. O. Smith,限制性內(nèi)切酶的剪切方式,粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個(gè)尾，這2個(gè)尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補(bǔ)的，在適當(dāng)條件下可以再連接一起。,其它工具酶,連接酶T4 DNA修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加polyA 或polyT 尾反轉(zhuǎn)錄酶,載體－宿主系統(tǒng),載體(vector)是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增

55、和表達(dá)的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。,載體應(yīng)具備以下條件：,１、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源DNA插入；３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。,宿主細(xì)胞必須符合以下條件,１、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒

56、有嚴(yán)格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；４、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。,目的基因的獲取,一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA。可去除真核生物基因中不表達(dá)的內(nèi)含子。,,二、化學(xué)合成法

57、制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。,PCR技術(shù),根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。特點(diǎn)：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。,DNA擴(kuò)

58、增,,PCR反應(yīng),DNA片斷的克隆,載體的條件 ：,a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn)c 選擇標(biāo)記,DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。,一、DNA連接酶,DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連

59、接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。,重組DNA導(dǎo)入宿主菌,體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。,一、轉(zhuǎn) 化,指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短

60、暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。,二、轉(zhuǎn)染和感染,利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。,重組克隆的篩選與鑒定,基因

61、克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。,一、抗藥性標(biāo)志的篩選,如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr或tetrr ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基

62、因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。,二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選,很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個(gè)氨基酸，稱為α－肽，它表達(dá)β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補(bǔ)。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補(bǔ)，在

63、含X-gal的平板上，含陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑。,三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對(duì)于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。,重組DNA的鑒定,遺傳學(xué)方法,第七節(jié) 雜交育種,

64、(一)細(xì)菌雜交,在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài)(F+細(xì)胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。,（二）酵母雜交育種技術(shù),1、酵母繁殖方式 酵母為單

65、細(xì)胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。,,單倍體細(xì)胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間，則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配。在生活過程中，酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。,2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同

66、基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運(yùn)用罕見交配法更易獲得結(jié)果。,第八節(jié) 原生質(zhì)體育種,原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上

67、提出來的。,一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn),(一)雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。,(四)存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產(chǎn)量

68、的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。,二、原生質(zhì)體融合育種步驟,1．標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2．原生質(zhì)體制備。3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選。,三、原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn),（一）標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的