菌種退化復(fù)壯與保藏

1、第四節(jié) 菌種退化、復(fù)壯與保藏,在生物進(jìn)化中： 遺傳性的變異是絕對的，穩(wěn)定性是相對的； 在變異中： 退化性的變異是大量的，進(jìn)化性的變異是個(gè)別的。,一.菌種的退化,1.菌種退化degeneration的表現(xiàn) 生產(chǎn)性狀的劣化,遺傳標(biāo)記的丟失, 原有的典型性狀的不典型等菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變生長速度緩慢代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即負(fù)突變致病菌對宿主侵染力下降抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低溫）能

2、力減弱,2. 菌種退化的原因：基因自發(fā)突變退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。 自發(fā)突變率10-8-10-9 加速退化的因素傳代次數(shù)過多不適宜的培養(yǎng)條件,3.防止退化的措施（1）控制傳代次數(shù)（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度等 保藏培養(yǎng)基： 細(xì) 菌：營養(yǎng)瓊脂 放線菌：高氏一號(hào) 霉 菌：察氏培養(yǎng)基 酵母菌：YEPD高滲培養(yǎng)基。（3）利用

3、不易衰退的細(xì)胞傳代：霉菌、放線菌：無性孢子或有性孢子（4）采用有效的菌種保藏方法,二. 菌種的復(fù)壯 rejuvenation,狹義復(fù)壯 在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；,廣義復(fù)壯 在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體

4、。也稱生產(chǎn)育種,1.純種分離法,菌株：又稱品系,表示任何由一個(gè)獨(dú)立分離的單細(xì)胞(或單個(gè)病毒粒子)繁殖而成的純種群體及其后代。因此,一種微生物的每一個(gè)不同來源的純培養(yǎng)物均可稱為該菌種的一個(gè)菌株。,2、通過宿主體復(fù)壯：病原菌3、淘汰已衰退的個(gè)體 對S. microflavus“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子采用-10～-30℃的低溫處理5～7天，使其死亡率達(dá)到80%左右，結(jié)果會(huì)在抗低溫的存活個(gè)體中留下未退化的個(gè)體，從而達(dá)到復(fù)

5、壯的效果。,三. 菌種的保藏,（一）目的 使微生物菌種保持原來的性狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用 。（二）原理 挑選典型培養(yǎng)物（typical culture）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑、生長受抑制的休眠狀態(tài)。,措施 低溫：生長溫度低限約為-30℃，水溶液中酶促反應(yīng)溫度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏營養(yǎng) 添加保護(hù)劑

6、：甘油、脫脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和劑,（三）菌種保藏方法1.斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基 → 培養(yǎng) → 4℃保藏 措施：低溫：4℃ 適用：各大類 保藏期：1-6個(gè)月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長保藏時(shí)間2.石蠟油封藏法 方法：斜面或半固體接種 → 培養(yǎng) → 加無菌蠟液高出培養(yǎng)基1cm→4-15℃保藏 措施：低溫，隔氧 適用：不能利用石油的各大類 保藏期：1

7、-2年優(yōu)點(diǎn)：簡便,3.砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢懸液 → 加入無菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏 措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥 適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物 保藏期：1-10年4.冷凍干燥保藏 方法：菌種培養(yǎng) → 用保護(hù)劑懸浮 → 加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 檢查真空度 → 保藏 措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑 適用

8、：各大類 保藏期：5-15年或更長,5.甘油懸液低溫冷凍保藏法 方法：菌種培養(yǎng) → 15-30%甘油緩沖液懸浮 → 加入保藏管中 → 置 -70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年 6.液氮保藏法方法：菌種培養(yǎng) → 保護(hù)劑懸浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶中 措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑 適用：各大類保藏期：>15年,（四）

9、菌種保藏機(jī)構(gòu)1.中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) CCCCM中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC(歸口中國科學(xué)院) 中國科學(xué)院微生物研究所(AS) 中國科學(xué)院武漢病毒研究所(AS-IV) 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC(歸口中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所(ISF) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC(歸口輕工業(yè)總會(huì))中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所(IFFI),中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保

10、藏中心CMCC(歸口衛(wèi)生部) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(ID)，南京 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所(NICPBP) 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所 中國抗生素微生物菌種保藏中心CACC(國家醫(yī)藥管理局) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 華北制藥廠抗生素研究所(IANP), 石家莊,中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心CVCC(歸口農(nóng)業(yè)