微生物藥物產(chǎn)生菌菌種的保藏與質(zhì)量控制

1、微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏和質(zhì)量控制,劉紅宇,2,微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種保藏與質(zhì)量控制,主要內(nèi)容,,,,微生物藥物產(chǎn)生菌主要包括細菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥物大約近兩萬種。,抗細菌:青霉素(Penicillin) P. notatum降血脂:他汀類(Statins) P. brevicompactum, A. terreus, Monascus ruber免疫

2、抑制劑:環(huán)孢素(Cyclosporin A) Tolypocladium inflatum 抗真菌:棘白霉素類(Echinocandins) A. nidulans,一、微生物藥物產(chǎn)生菌,,,實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄，應(yīng)有菌種管理的程序文件—2015中國藥典標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄；菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做純度、特性等實驗室所需關(guān)鍵指

3、標的確認，并記錄；每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數(shù)；菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序.,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,,,,,,對 活 純 性狀穩(wěn)定,微生物菌種實物管理微生物菌種信息管理保證菌種實物與信息的一致性,實物管理,信息管理,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,菌種的來源應(yīng)來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標準菌株，使用與標準

4、菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。 -2015版中國藥典,實物管理,信息管理,,標準菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按已驗證的方法進行;標準菌株如果經(jīng)過確認試驗證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時，應(yīng)及時滅菌銷毀；標準儲備菌株應(yīng)進行純度和特性確認。 -2015版中國藥典,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,,實物管理,信息管理,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,微生物藥物產(chǎn)生菌經(jīng)過多次傳代或長

5、期保持菌種的一個或多個優(yōu)良特性逐步減退或消失，稱為微生物藥物產(chǎn)生菌菌種的退化。,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,在實際生產(chǎn)中，培養(yǎng)條件的變化也會導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變化，但是只要培養(yǎng)條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此培養(yǎng)條件引起的菌種變化是不能稱為菌種退化的。,藥用微生物產(chǎn)生菌菌種退化的鑒別,,,,,,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產(chǎn)能力等方面的變化：1.細胞

6、形態(tài)改變，產(chǎn)孢子能力下降。2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?.對不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵染的抵抗力下降。4.營養(yǎng)需求發(fā)生改變。5.在生產(chǎn)上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生產(chǎn)能力下降，生產(chǎn)的速度變慢。,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,,,,,防止微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的方法,,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,1.控制轉(zhuǎn)接傳代次數(shù)2.采用良好的培養(yǎng)條件3.采用有效保藏方法,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的原因,1.自發(fā)突

7、變與回復(fù)突變2.細胞本身自我調(diào)節(jié)和修復(fù)3.環(huán)境條件的影響,,,,,,適合的菌種保藏方法保證菌種的存活并防止菌種退化,冷凍干燥保藏法 -80度低溫冷凍法 液氮超低溫保藏法,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等方法保存；低于-70℃或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時間。---2015版 中國藥典,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍干燥保藏法,冷凍干燥保

8、藏法是將菌種懸液在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中的水分,使得菌種處于干燥、低溫和缺氧的條件下，從而得以長期保存的菌種保藏法。原理：將含水量大的微生物菌種預(yù)先冷凍在真空條件下利用升華現(xiàn)象除去水分，細胞的生理活動趨于停止，從而能夠長期維持生活狀態(tài)。適用范圍：大多數(shù)細菌和放線菌。部分真菌和酵母菌。優(yōu)點：保存時間長、輸送、貯存方便等優(yōu)點。 缺點：冷凍干燥過程對細胞有損傷,操作步驟繁多，需要一定設(shè)備。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍

9、干燥保藏法,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,安瓿管準備,酸洗,水洗,蒸餾水洗,加標簽及棉塞,滅菌,菌種,制備菌液,培養(yǎng)（固體或液體）,分裝安瓿管,安瓿管預(yù)凍,冷凍干燥開始,適當(dāng)升溫（促進干燥）,凍干結(jié)束,安瓿管封口,檢查真空度,保護劑的選擇與準備,分裝,滅菌,保藏（低溫避光）,,冷凍干燥過程的影響因素,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍干燥保藏法的影響因素,微生物菌種不同發(fā)育階段 菌體濃度 降溫速率

10、 保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用 合適的凍干曲線 二次抽真空 復(fù)水及培養(yǎng)條件,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,-80度低溫冷凍法,將欲保存的菌種懸液密封于凍存管后儲藏于-80℃的冰箱中的保藏方法。原理：使微生物處于低溫狀態(tài)下使細胞的代謝減緩或趨于停止。 適應(yīng)范圍：各種類型微生物。優(yōu)點：簡便有效，在沒有液氮的地區(qū)購置深凍冰箱保藏菌種較易推廣。缺點：斷電或機械故障菌種易融化死亡。

11、,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,液氮超低溫保藏法,將欲保存的菌種懸液密封于凍存管中，經(jīng)控制速度凍結(jié)后，儲藏于-196℃ 的液態(tài)氮或-150℃的氣態(tài)氮中的長期保藏方法稱為液氮超低溫保藏法。原理：微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止。在此溫度下保藏，微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。 優(yōu)點：保存時間長,死亡率低,變異少,活性相對穩(wěn)定。缺點：某些地方液氮不易得到適用范圍：各類微生

12、物,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,-80度低溫凍結(jié)與液氮保藏比較,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,-80度低溫冷凍法 & 液氮超低溫保藏法的影響因素,微生物菌種的發(fā)育階段 菌體濃度 降溫速率 保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用 升溫速率及培養(yǎng)條件,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,微生物菌種不同發(fā)育階段與保藏的關(guān)系,細菌和酵母菌凍干靜止期菌齡的細胞，其存

13、活率高于對數(shù)生長期和衰老期的細胞，幼齡和老齡細胞均不適用。對于放線菌要求形成成熟的孢子為宜，而幼齡和老齡的細胞對凍干比較敏感。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,菌體濃度對于抗生素產(chǎn)生菌存活力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,控制降溫速率,D.Smith等人應(yīng)用溫控冷凍光顯微術(shù)（Temperature-controlled Crygenic Light microscopy）觀察真菌在冷凍與融化過程

14、中引起細胞的損傷情況。發(fā)現(xiàn)不同種對于冷凍產(chǎn)生不同反應(yīng)冷凍光顯微術(shù)的使用，可以更直接觀察到冷凍速率對細胞的影響，指導(dǎo)降溫速率的控制，提高菌種的遺傳穩(wěn)定性。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,控制降溫速率,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,據(jù)報道酵母合適的冷凍速度為3-10℃/min，乳酸菌為3-5℃/min，放線菌為1℃/min。,使細胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死 亡；作為支持物

15、和受體在復(fù)水過程中為干物質(zhì)提供一定的骨架結(jié)構(gòu)，防止復(fù)水時引起的死亡，并使菌體容易從休眠狀態(tài)恢復(fù)為生長發(fā)育狀態(tài)。 據(jù)報道適合的保護劑可以使微生物細胞的成活率接近99.8%。保護劑是保護性溶質(zhì)，通過氫和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細胞成分的構(gòu)型，保護劑可替代結(jié)合水而穩(wěn)定細胞的構(gòu)型。對某些微生物，加保護劑反而有害。,保護劑的作用,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,很多菌種保藏機構(gòu)如美國ATCC采用的保護劑多達有10

16、0多種。如脫脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常與其他物質(zhì)混合使用。,保護劑的種類,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌存活率的影響,不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌生產(chǎn)能力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,,不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌生產(chǎn)力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,抗誘變劑及修飾劑的使用,在菌種保藏過程中添加抗誘變劑

17、可以減少突變體產(chǎn)生，阻礙誘變劑同DNA的相互作用?？拐T變劑具有高度特異性。抗誘變劑主要有：嘌呤核苷酸、錳離子、L-甲硫氨酸、組氨酸、精胺、多氨、咖啡因等。近年來還發(fā)現(xiàn)一些修飾劑（如對氨基苯甲酸）對于鏈霉菌性狀的穩(wěn)定有實際意義。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,,共晶點的概念,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,溶液隨溫度降低而發(fā)生凝固凍結(jié)，達到全部凝固凍結(jié)的溫度稱為凝固點或稱共晶點。不同物質(zhì)的凝固點不同。

18、由于凍干是在真空狀態(tài)下進行的，只有制品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華。,,保護劑與共晶點,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,Eutectic Temperature, Glass-Transition Temperature, and Temperature Primary Drying Phase of Various Lyoprotectants,Na-gl, Na-glutamate; sm, skim milk;

19、Teut, eutectic temperature; Tg, glass-transition temperature; T prim. Dr. phase, primary drying phase; tr, trehalose.,,共晶點的測定,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,當(dāng)溫度降低時電阻增大，當(dāng)降到共熔點時電阻即出現(xiàn)突然增大現(xiàn)象，此時的溫度即是該溶液物質(zhì)的共熔點。,1.保藏方法各個環(huán)節(jié)的細化和完善 降溫速率

20、的控制 保護劑 抗誘變劑的種類增多 共晶點測定 適合的凍干曲線2.玻璃化速凍 部分真菌保藏,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法新進展,網(wǎng)址: http://www.cpcc.ac.cn地址: 北京市天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所郵編: 100050微生物菌種購買和保藏, email: cpcc@cpcc.ac.cn Tel: 01063161934微生物菌種鑒定email: taxo