藥品微生物控制菌檢查及菌種鑒定-基因分型方法的研究.pdf

1、在科學(xué)技術(shù)日新月異的今天，隨著分子生物學(xué)和微電子技術(shù)的飛速發(fā)展，快速、準(zhǔn)確、特異檢驗的微生物新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，微生物檢驗技術(shù)由培養(yǎng)水平向分子水平邁進，并向儀器化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，提高了微生物檢驗工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。但是在藥品檢驗領(lǐng)域，微生物鑒定技術(shù)甚少。菌株隨著環(huán)境的變遷不斷發(fā)生著遺傳變異，許多控制菌株在按照標(biāo)準(zhǔn)檢驗時，周期長，有時出現(xiàn)假陰性。目前，中國藥典逐漸與歐洲藥典、美國藥典和日本藥局方協(xié)調(diào)一致，在控制菌鑒

2、定方面也做出了“適宜的鑒定方法確證”的要求。因此，獲得適宜的控制菌檢查和鑒定技術(shù)是檢驗結(jié)果高效、準(zhǔn)確和可靠的基本保證。
　　銅綠假單胞菌，是臨床常見重要條件致病菌之一，也是藥典收載的局部用藥的重要控制菌，有較高的死亡率。其易定植、易變異和多耐藥，廣泛存在于土壤、水、空氣及人體皮膚、呼吸道與腸道。目前，該菌是藥品、化妝品以及實驗動物檢驗中一項重要的微生物控制指標(biāo)。
　　對于正常樣品來講，一般需經(jīng)過滅菌處理，殘存菌株都或多或少受

3、過不同程度的損傷，要通過某些培養(yǎng)基復(fù)蘇到能夠被檢出的程度，勢必需要滿足靈敏度高、起始增菌時間短、增菌濃度高的要求。雖然藥典明確提出了培養(yǎng)基適用性檢查的必要，但是來源不同的培養(yǎng)基，即使?jié)M足了中國藥典或其它標(biāo)準(zhǔn)的基本要求，其靈敏度也有一定差異。
　　由于檢測儀器的限制，要獲得較多的實驗數(shù)據(jù)，檢驗工作極其繁瑣，是該類微生物實驗進行的一個瓶頸問題。傳統(tǒng)鑒別方法日益暴露出種種弊端，越來越不適應(yīng)消費者快餐式的現(xiàn)代消費理念。在追求快速、簡便檢測

4、的同時，更希望結(jié)果的準(zhǔn)確性。本課題以銅綠假單胞菌為典型代表，選擇不同來源的9株陽性菌株和國內(nèi)外16種培養(yǎng)基利用酶標(biāo)儀在線檢測OD值繪制生長曲線的方式，重點探索最適宜的液體增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，大大減少了工作量，走在了增菌培養(yǎng)基篩選技術(shù)的前沿。同時對上述9株陽性菌株生化鑒定及分型方法做了進一步的探索實驗。
　　目的:采用擇優(yōu)錄取的方式，在一定培養(yǎng)條件下，評選出優(yōu)質(zhì)、高靈敏度的液體增菌培養(yǎng)基;采用傳統(tǒng)鑒定方法、國際金標(biāo)準(zhǔn)鑒定技術(shù)、熒光

5、檢測和基因分型，從而在最直接、最經(jīng)濟的鑒定與基因分型方法檢驗過程中發(fā)現(xiàn)隱含的漏檢因素，為藥品、化妝品以及實驗動物檢驗提供參考。
　　方法:液體增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選，通過對生長曲線圖中關(guān)鍵參數(shù)和綠膿菌素的濃度、菌膜生長情況對比情況，擇優(yōu)錄取。將新鮮菌株進行傳統(tǒng)方法鑒定、API試劑條鑒定、VITEK2 compact型全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定、血清分型、熒光定量PCR鑒定、RAPD基因分型。
　　結(jié)果:TSB培養(yǎng)基是最符合

6、質(zhì)量要求的一種液體培養(yǎng)基，并且國內(nèi)外各生產(chǎn)單位提供的產(chǎn)品質(zhì)量差異很小。在35℃培養(yǎng)條件下最適宜的增菌時間是48小時，適當(dāng)?shù)难娱L增菌時間增加陽性檢出率，如有必要可以延長至72小時。
　　傳統(tǒng)鑒定方法、API試劑條鑒定、VITEK2 compact型全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定、血清分型、熒光定量PCR鑒定，陽性檢出率均為100％;RAPD基因分型，陽性檢出率為0％。
　　結(jié)論:篩選的TSB培養(yǎng)基，在一定培養(yǎng)條件下，靈敏度高、起始增

7、菌時間短、增菌濃度高，最適于銅綠假單胞菌的增菌。
　　采用傳統(tǒng)鑒定方法，有時遇到菌株不同程度表型變異，使綠膿菌素或菌膜的產(chǎn)生時有時無，引起生化試驗鑒別反應(yīng)變動。因而單純依靠綠膿菌素或菌膜的有無決定是否進一步試驗，可能有些片面。API試劑條鑒定和VITEK2 compact型全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定全部檢出陽性菌株，鑒定率為100％。API試劑條讀數(shù)受人為因素影響較大，后者則避免了人為誤差，鑒定結(jié)果較為可靠。
　　采用免疫血清

8、結(jié)果的可靠性影響因素較多，除了靈敏度外，還和菌齡、菌株分純程度、使用工具的材質(zhì)及潔凈程度等有關(guān)。操作雖簡單，但結(jié)果重復(fù)性差。
　　RAPD基因分型技術(shù)需提供的DNA樣本純度高，即對DNA提取的試劑及試驗過程要求較高。相比之下熒光定量PCR鑒定儀的靈敏度更高些，但直接經(jīng)過裂解的產(chǎn)物和在有其它相似菌株存在的情況下，特異性還需要進一步改進。即便是在同一樣本下，廠家提供的和本人做出的檢驗結(jié)果有些出入，除了操作誤差外，還和試劑添加比例、試劑