深低溫保存血小板制備與質(zhì)量控制

1、,由于冰凍保存血小板有良好的臨床止血效果和可根據(jù)需要長(zhǎng)期大量庫存的優(yōu)點(diǎn)，理想的血小板冰凍保存技術(shù)研究日益受到關(guān)注。血小板是成份輸血的重要部分，它對(duì)各種原因引起的血小板減少，起到了藥物不可替代的治療作用。血小板的臨床止血效果，與所輸注的血小板數(shù)量和質(zhì)量關(guān)系密切。正確掌握冰凍保存血小板的整個(gè)制備過程中的制備技術(shù)和質(zhì)量控制方法，才能提高我們制備的血小板的得率和質(zhì)量。,簡(jiǎn)單流程,離心機(jī),冰箱,血小板,,,ACD200ml采血袋全血,,,全

2、血,簡(jiǎn)單流程,,,DMSO,-80℃,冰凍血小板,,,血小板,,,冰凍血小板,血小板,,,DMSO,所需儀器設(shè)備,超濾DMSO裝置G6漏斗、電動(dòng)吸引器,全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,德國(guó)Heraeus離心機(jī)Cryofuge 8000或6000I,超凈工作臺(tái),血細(xì)胞分離機(jī),-80℃低溫冰箱,38℃循環(huán)式水浴箱,分漿夾、熱合機(jī),24G頭皮針一次性10ml無菌注射器,稱量?jī)x、自動(dòng)加樣器,冰凍保護(hù)劑DMSO準(zhǔn)備,,,G6漏斗、收集瓶、分裝瓶的準(zhǔn)

3、備將G6漏斗、收集瓶、分裝瓶先用長(zhǎng)水沖洗，硫酸-高錳酸鉀液浸泡24小時(shí)，流水沖洗后用雙蒸水沖洗、浸泡，然后包裝，通過高壓蒸汽消毒（136℃，6-8分鐘）。,,超濾后500ml/瓶分裝好避免光，置于潔凈環(huán)境室溫保存。,DMSO的超濾和保存在無菌間，超凈工作臺(tái)中，將購置的DMSO用G6漏斗負(fù)壓抽濾。,冰凍血小板制備方法,,從全血采集到制備血小板的全過程，均要求在22±2℃環(huán)境中6小時(shí)內(nèi)完成（包括離心溫度）。即使不立即制備，也不

4、要將全血放入冰箱4℃保存，以免影響血小板質(zhì)量。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,新鮮富含血小板血漿（FPRP）制備最佳離心分離條件選擇,,離心是制備冰凍富含血小板血漿最重要的環(huán)節(jié)之一。選擇最佳離心條件的目的，是為了使獲得的富含血小板血漿中血小板濃度較高，而紅細(xì)胞、白細(xì)胞污染少。選擇最佳離心條件的方法需要根據(jù)各單位的具體條件來確定。,最佳離心條件選擇方法,,我科采用析因設(shè)計(jì)確定最佳離心條件。測(cè)定ACD全血、FPRP內(nèi)血小板計(jì)數(shù)和

5、FPRP體積，計(jì)算所得血小板數(shù)和血小板得率，確定最佳離心條件。,冰凍血小板制備方法,,室溫(18-22℃左右)條件下，用三聯(lián)采血袋采集健康獻(xiàn)血者ACD-B抗凝全血200ml。要求采血流暢，采血時(shí)間＜3min。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明采用德國(guó)Heraeus Cryofuge 8000和6000I離心機(jī)，加速度為9檔，減速度為4檔的條件下，在400-650g離心5-11min 血小板得率較高。,冰凍血小板制備方法,,冰凍血小板制備方法,,,,二因素,離心

6、力,離心時(shí)間,400g,480g,560g,650g,5min,7min,9min,11min,四水平,組合成16種離心條件,,,通過計(jì)算各條件下血小板得率，同時(shí)參考白細(xì)胞和紅細(xì)胞污染率，選取最佳離心條件。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,結(jié)果,,22℃±2℃條件下，采用德國(guó)Heraeus Cryofuge 8000離心機(jī)，加速度為9檔，減速度為4檔，480g，離心7min條件下，平均得率為70%。紅細(xì)胞污染≤1

7、15;109/單位；白細(xì)胞污染≤5×107/單位。,冰凍血小板制備方法,,從ACD全血離心制備的FPRP質(zhì)量，不僅與離心機(jī)的離心速度有關(guān)，而且與血液體積、血球壓積、離心機(jī)啟動(dòng)加速度和減速度密切相關(guān)。其中離心機(jī)性能非常重要。,冰凍血小板制備方法,,由于離心后ACD全血中的紅細(xì)胞壓得不緊，容易因?yàn)檎駬u和非勻速運(yùn)動(dòng)而泛起，混入FPRP中。共振明顯的離心機(jī)不適于制備富含血小板血漿。合適的離心機(jī)減速度檔選擇低檔較好。,冰凍血小板制備方法

8、,,離心時(shí)要采取措施如仔細(xì)系綁等，防止血袋在離心杯內(nèi)出現(xiàn)皺折或塌伏，減少分離時(shí)紅細(xì)胞污染。,冰凍血小板制備方法,,離心完畢，要輕拿輕放，盡量減少搬動(dòng)次數(shù)。最好將離心好的血液直接從離心杯中輕輕轉(zhuǎn)移到分漿夾中。分離上層FPRP應(yīng)該用止血鉗控制速度。速度以慢為好，至少要先快后慢。否則將會(huì)減少血小板得率，增加紅細(xì)胞和白細(xì)胞污染。,冰凍血小板制備方法,添加冰凍保護(hù)劑DMSO,,二甲基亞砜在冰凍血小板中作用,冰凍血小板制備方法,,二甲基亞砜（DM

9、SO）:化學(xué)試劑、分析純、分子式：C2H6OS、分子量：78.13，凝點(diǎn)約18.3-18.5℃、沸點(diǎn)：189-192℃，比重：1.099-1.109g/ml,為無色稀薄液體、略帶苦味，易吸潮、具特殊臭味（大蒜樣味）。,冰凍血小板制備方法,,本藥品口服及皮膚給藥均易吸收，皮下注射4-8小時(shí)，一部分以原形從尿中排泄、還有少部分經(jīng)肺排出。,冰凍血小板制備方法,,DMSO在冰凍血小板中主要作為一種防凍劑，保護(hù)血小板膜。在緩慢加入DMSO時(shí)，DM

10、SO將血小板包圍起來，既起到保護(hù)作用又可抑制血小板的凝集、聚合作用。,冰凍血小板制備方法,,DMSO有抑菌作用，DMSO濃度為8%時(shí)，能抑制92%的綠膿桿菌生長(zhǎng)、濃度為15%時(shí)，能抑制９８％的大腸桿菌和巨大芽胞桿菌生長(zhǎng)、但高濃度使用本品不能代替滅菌。,冰凍血小板制備方法,,DMSO使用前要經(jīng)G6漏斗濾除雜物、細(xì)菌、熱原質(zhì)等。裝放在潔凈無菌的玻璃瓶中，室溫保存。,DMSO添加方法,,離心后輕輕分離上層新鮮PRP（FPRP），經(jīng)過稱量，在潔

11、凈的環(huán)境中采用無菌技術(shù)，用一次性10ml注射器和24G頭皮針緩慢（＞5min）加入超濾DMSO，終濃度為5% 。,冰凍血小板制備方法,,需要添加DMSO量的簡(jiǎn)單計(jì)算方法：DMSO（ml）=富含血小板血漿（ml）×0.05在加入DMSO過程中，要用一定強(qiáng)度充分混勻，避免局部產(chǎn)熱。盒裝后直接放入-85℃冰箱保存。,冰凍血小板制備方法,冰凍血小板制備方法,,5%DMSO在室溫下2-3小時(shí)內(nèi)對(duì)血小板通常無明顯毒性作用。加入5%DM

12、SO后，血小板激活標(biāo)志物CD62p（P選擇素）和磷脂酰絲氨酸陽性率稍微增加，這與DMSO加入方式有關(guān)。,冰凍血小板制備方法,,將高濃度的DMSO加入FPRP中會(huì)有局部產(chǎn)熱現(xiàn)象，如果加入過快，可使局部溫度過高，引起血小板激活。,冰凍血小板制備方法,,CD62p陽性率升高幅度與DMSO添加的速度和混合方式密切相關(guān)。過快的添加速度和劇烈振蕩可以使CD62p陽性率明顯升高。在DMSO加入的過程中，人工添加要求采取正確的振蕩方式和合適的添加速度。

13、最好采用機(jī)械自動(dòng)加入和自動(dòng)搖床，有利于操作標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制。,富含血小板血漿質(zhì)控,,※ 檢測(cè)獻(xiàn)血者外周血血小板計(jì)數(shù) 要求獻(xiàn)血者PLT＞150×109/L※ 要求分離后血小板個(gè)數(shù)＞2.0×1010個(gè)/袋 紅細(xì)胞污染≤1×109/U 白細(xì)胞污染≤5×107/U※ 每月抽樣5袋，做血小板，白細(xì)胞 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)，及五項(xiàng)實(shí)驗(yàn) （A

14、LT，HBsAg，HCV，HIV，USR）,機(jī)采濃縮血小板冰凍保存,,取機(jī)采新鮮濃縮血小板，在潔凈的環(huán)境中采用無菌技術(shù)，用一次性10ml注射器和24G頭皮針往血小板收集袋中，緩慢（＞10分鐘）加入超濾DMSO，終濃度為5%。需要添加DMSO量的簡(jiǎn)單計(jì)算方法同上。折疊好，盒裝后直接放入-80℃冰箱保存。,冰凍血小板解凍和使用,,根據(jù)患者需要的治療劑量，取出相應(yīng)數(shù)量的冰凍PRP，置于38-42℃循環(huán)式水浴箱快速解凍。 輸注方法同液體保存