疫苗制造基本程序新

1、一、細(xì)菌性滅活疫苗制造,細(xì)菌性滅活疫苗簡(jiǎn)稱(chēng)滅活菌苗，種類(lèi)、苗型甚多，但制造的基本程序差別不大。,（一）菌種與種子,1.菌種 制苗用菌種多數(shù)為毒力強(qiáng)、免疫原性?xún)?yōu)良的菌株，通常使用1-3個(gè)品系，均由中國(guó)獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、凍干保存和供應(yīng)。 各種用于制造菌苗的菌種應(yīng)按規(guī)定定期復(fù)壯，并進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準(zhǔn)許用于制苗。,2.種子培養(yǎng) 將經(jīng)鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的菌種接種于

2、菌苗生產(chǎn)規(guī)程中所規(guī)定的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查、活菌計(jì)數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后即為種子液，用于菌苗生產(chǎn)。 種子液通常保存于2-8?C冷暗處，不得超過(guò)規(guī)程規(guī)定的使用期限。,（二）菌液培養(yǎng),大量生產(chǎn)的細(xì)菌培養(yǎng)方法甚多，既有手工式的，也有機(jī)械化或自動(dòng)化的培養(yǎng)方式。 機(jī)械化或自動(dòng)化的培養(yǎng)方式通稱(chēng)為反應(yīng)缸培養(yǎng)法，可供選擇的菌液培養(yǎng)法有：液體靜置培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法及連續(xù)培養(yǎng)法等。,菌液培養(yǎng)也可采用固體培

3、養(yǎng)法，該方法易獲得高濃度的細(xì)菌懸液，易稀釋成不同濃度，且含培養(yǎng)基的成分較少，所以比較適用于制備診斷用的抗原。,（三）滅 活,滅活菌苗通常根據(jù)細(xì)菌的特性加入最有效的滅活劑，采取最適當(dāng)?shù)臏缁顥l件進(jìn)行，幾種滅活菌苗的滅活方法如表6-1所示。,表6-1 幾種滅活菌苗的滅活方法,（四）濃 縮,為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養(yǎng)過(guò)程中采取提高菌數(shù)的基礎(chǔ)上，再通過(guò)濃縮方法達(dá)到目的。 常用的濃縮方法：氧化鋁膠吸附沉淀法

4、 離心沉降法 羧甲基纖維沉淀法 以上方法可使菌液濃縮一倍以上。 此外，有些細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生分子量小的可溶性抗原（如豬丹毒桿菌產(chǎn)生的糖蛋白）也可經(jīng)氫氧化鋁吸附濃縮；將破傷風(fēng)脫毒液按鹽酸—食鹽法處理，以作進(jìn)一步精制成提純破傷風(fēng)類(lèi)毒素。,,（五）配苗與分裝,由于滅活菌苗

5、所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。 豬肺疫氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時(shí)，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經(jīng)甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。 有的廠(chǎng)家禽霍亂油佐劑菌苗的配制程序?yàn)椋河跍缇挠腿閯?35m110號(hào)白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。 配苗和分裝：應(yīng)充分混勻，及時(shí)塞塞、貼簽或印字。,二、

6、細(xì)菌性活疫苗制造,弱毒菌種多系凍干品，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、保存與分發(fā)，少數(shù)由國(guó)家指定單位鑒定、保存與供給。 菌種使用前應(yīng)按規(guī)程規(guī)定進(jìn)行復(fù)壯、挑選，并作形態(tài)、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標(biāo)準(zhǔn)后方可用于制苗。 將檢定合格的菌種接種子于規(guī)定的培養(yǎng)基，按規(guī)定的條件增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查及有關(guān)的檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在0～4?C可保存2個(gè)月，在保存期內(nèi)可作為菌苗生產(chǎn)的批量種子使用。,細(xì)菌性活

7、疫苗多指弱毒菌苗，盡管種類(lèi)與苗型甚多，但基本制造程序相同。,（一）菌種與種子,按1%～3%量將種子液接種于培養(yǎng)基，然后依不同菌苗要求進(jìn)行培養(yǎng)。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養(yǎng)中加入適當(dāng)植物油作消泡劑，通入過(guò)濾除菌的熱空氣進(jìn)行培養(yǎng)制造菌液；又加布氏桿菌豬2號(hào)與羊5號(hào)弱毒菌經(jīng)固體表面培養(yǎng)完成后須按規(guī)定要求將菌苔洗下制成菌液。 菌液于0～4?C暗處保存，待抽樣經(jīng)純粹、活菌數(shù)等檢查合格后使用。,（二）菌液培養(yǎng),為提高某些弱毒菌苗

8、的免疫效果，可進(jìn)行濃縮，以提高單位活菌數(shù)，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內(nèi)加入0.2% ～0.25%羧甲基纖維素(CMC)進(jìn)行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應(yīng)抽樣作純粹、活菌數(shù)等檢查。,（三）濃縮,經(jīng)檢驗(yàn)合格的菌液，按規(guī)定比例加入保護(hù)劑配苗，充分搖勻后隨即進(jìn)行分裝，分裝量必須準(zhǔn)確。 分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進(jìn)行預(yù)凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫(kù)保存，并由質(zhì)檢部門(mén)

9、抽樣檢驗(yàn)。,（四）配苗與凍干,流程圖1——細(xì)菌疫苗和類(lèi)毒素制造工藝流程,蛋白質(zhì)、肉浸液等原料,培養(yǎng)基,細(xì)菌分離,菌 種,弱毒菌種,配置、滅菌,鑒定,減毒,濾過(guò),脫毒,純化,加吸附劑吸附,檢驗(yàn),配制滅菌,檢驗(yàn),檢驗(yàn),配制滅菌,原 料,佐 劑,滅活菌液,配苗、乳化,滅活疫苗,培 養(yǎng),菌苗原液,配 苗,活疫苗,保護(hù)劑,類(lèi)毒素,毒 素,純化類(lèi)毒素,菌 液,分裝、凍干,分 裝,滅活,原 料,精制類(lèi)毒素,活化種子,,,,,,,,,,

10、,,,,,,,,,,,,,,,,三、病毒性動(dòng)物組織疫苗制造,病毒在易感動(dòng)物體內(nèi)可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱(chēng)為組織疫苗(tissue vaccine)。 動(dòng)物組織疫苗包括動(dòng)物組織滅活疫苗和動(dòng)物組織弱毒活苗兩類(lèi)，前者多數(shù)由強(qiáng)毒株制造，如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產(chǎn)，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。,動(dòng)物

11、質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量，特別是對(duì)疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動(dòng)物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)： (1)應(yīng)該是清潔級(jí)(二級(jí))以上的等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，即無(wú)規(guī)定的人獸共患性病原體動(dòng)物； (2)應(yīng)是對(duì)所接種病毒易感性高的動(dòng)物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。,（一）動(dòng)物選擇,種毒既可用抗原性?xún)?yōu)良、致死力強(qiáng)的自然毒株臟器組織毒或強(qiáng)毒株增殖培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。無(wú)論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原

12、性檢查合格后使用。 接種途徑依病毒性質(zhì)和目的而異，例如豬瘟結(jié)晶紫苗，采取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內(nèi)途徑感染。 幾種動(dòng)物常用的接種途徑如下： 1. 腦內(nèi)注射：顱前后中線(xiàn)5mm平行線(xiàn)與瞳孔橫線(xiàn)交叉處。 2. 靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。 3. 肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部

13、等肌肉豐滿(mǎn)處注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內(nèi)注射。 5. 腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。,（二）種毒與接種,動(dòng)物在接種感染后應(yīng)每天觀(guān)察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，指標(biāo)或項(xiàng)目因不同病毒而異。常規(guī)觀(guān)察、檢查的項(xiàng)目如食欲、精神和活動(dòng)狀態(tài)、體溫、糞便、尿和血液變化等。 根據(jù)觀(guān)察的征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動(dòng)物按規(guī)定方式剖殺，采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結(jié)晶

14、紫疫苗采取發(fā)病豬的血液制備；兔出血癥組織滅活疫苗采集病兔肝臟生產(chǎn)；狂犬病疫苗利用發(fā)病羊的羊腦組織制造。,（三）觀(guān)察與收獲,1．組織滅活疫苗 采取收獲的組織經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測(cè)定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結(jié)晶紫等）制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，于36?0.5?C滅活7天制成；豬瘟結(jié)晶紫疫苗配制，按血毒4份，結(jié)晶紫甘油溶液1份混

15、合，于37?C~38?C滅活6~8天。2. 弱毒組織疫苗 在無(wú)菌操作下剔除臟器上的脂肪與結(jié)締組織等，稱(chēng)重后剪碎，加入適最保護(hù)劑制成勻漿，然后濾過(guò)扣除殘?jiān)?，再按濾液中的實(shí)際組織量計(jì)算稀釋倍數(shù)，加入余量保護(hù)劑和青鏈霉素500~1000U(?g/ml)，充分搖勻后置0~4?C冷暗處處理一定時(shí)間后作無(wú)菌檢驗(yàn)與毒價(jià)測(cè)定。合格者進(jìn)行分裝，冷凍真空干燥制成凍干疫苗。,（四）制 苗,流程圖2——病毒性組織疫苗制造工藝流程,動(dòng) 物,

16、感染動(dòng)物,毒 株,種 毒,滅活病毒液,鑒定,培育,檢驗(yàn),檢驗(yàn),配制,原 料,佐 劑,配苗、乳化,滅活疫苗,含病毒組織,含病毒懸液,配 苗,活疫苗,保護(hù)劑,分裝、凍干,分 裝,滅活,原 料,,,,,,,,,,,,,,,,種 子,,擴(kuò)增,收獲,配制,,,純化病毒懸液,接種,四、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造,受精卵必須來(lái)自SPF雞群，至少源于未用抗生素藥物的非免疫雞群，以免受母源抗體的干擾和殘留抗生素的影響。 從受精卵

17、入孵開(kāi)始至培養(yǎng)全過(guò)程都應(yīng)保持無(wú)菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動(dòng)，然后選擇。選擇一定日齡、發(fā)育正常的胚用于接毒培養(yǎng)，5~8日齡胚適用于卵黃囊接種；9~11日齡胚用于尿囊腔接種；10~12日齡胚適于羊膜腔接種；11~12日齡胚用于絨毛尿囊膜接種。,痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和皰疹病毒等一類(lèi)生物制品，目前仍然利用禽胚特別是雞胚制備，如雞新城疫苗、鴨瘟雞胚化弱毒疫苗、犬瘟熱雞胚弱毒疫苗等。 禽胚疫苗生產(chǎn)的原材料來(lái)源方便、質(zhì)

18、量比較容易控制，制造程序簡(jiǎn)單，不需要過(guò)高的設(shè)備條件，生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量可靠。,（一）雞胚選擇,（二）種毒與毒種繼代,目前適應(yīng)于雞胚的種毒多系弱毒，包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類(lèi)。各種制苗用的種毒多數(shù)由國(guó)家菌毒種保藏部門(mén)或指定單位保存，保存的種毒多為凍干毒。 凍干毒種需按規(guī)定要求在雞胚繼代復(fù)壯，通常繼代3代以上，經(jīng)檢定符合標(biāo)準(zhǔn)后方可作力生產(chǎn)疫苗的毒種，毒種檢定內(nèi)容包括無(wú)菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測(cè)定和其他項(xiàng)目的檢定等。,（三）接毒與收獲,

19、雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒量?jī)煞矫?。根?jù)不同的病毒與不同疫苗生產(chǎn)程序，選擇最佳接種途徑和接種量。 接種途徑：絨毛尿囊膜接種 尿囊腔接種 羊膜腔接種 卵黃囊接種 如雞新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接種10~3稀釋毒種0.1ml，后者

20、接種10~4稀釋毒種0.1ml。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗采用絨毛尿囊膜接種50-100倍稀釋毒0.2ml。,1.接毒,雞胚接毒后培養(yǎng)增殖的時(shí)間和溫度、濕度以及收獲的標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)容物依不同的病毒和不同的疫苗而異。 如雞新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39?C、相對(duì)濕度60%~70%條件培養(yǎng)增殖，收集接毒后24~48h內(nèi)死亡胚，置0~10?C冷卻4~24h，收獲胚液，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，供制備濕苗用。 也可收獲胚液、胎兒及

21、絨毛尿囊膜混合制成乳劑制備凍干苗。 鴨瘟雞胚化弱毒疫苗，則收集接毒后48~120h內(nèi)死亡的雞胚，冷卻后采取絨毛尿囊膜、尿囊液、胎兒制造凍干苗用。,2.培養(yǎng)收獲,按規(guī)定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后即可進(jìn)行配苗。 1.濕苗 通常于雞胚液內(nèi)，按每毫升加入青霉素和鏈霉素500~1000U，放置0~10?C 冷暗處處理后分裝。 2.凍干苗 經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后合格的

22、胚液或胚液、胎兒、絨毛尿囊膜乳劑，按比例加入保護(hù)劑，充分混合后濾過(guò)，于濾液內(nèi)按每毫升加入青、鏈霉素500~1000U，混合后分裝凍干。 3.滅活苗 收獲雞胚液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測(cè)定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液，按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活，加入相應(yīng)的佐劑，制備成滅活疫苗，放置4-10?C保存。,（四）配 苗,流程圖2——病毒性組織疫苗制造工藝流程,受精卵,禽 胚,毒 株,種 毒,滅活病毒液,鑒定,培育,檢

23、驗(yàn),檢驗(yàn),配制,原 料,佐 劑,配苗、乳化,滅活疫苗,含病毒尿囊液或禽胚組織,含病毒懸液,配 苗,活疫苗,保護(hù)劑,分裝、凍干,分 裝,滅活,原 料,,,,,,,,,,,,,,,,種 子,,擴(kuò)增,收獲,配制,,,純化病毒懸液,接種,五、病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制造,用于制苗用的種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無(wú)菌檢定合格，通常為凍干品，由國(guó)家指定的苗毒種保藏部門(mén)檢定分發(fā)。 領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細(xì)胞繼代培養(yǎng)適應(yīng)后用作毒

24、種，制苗用毒種應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)以?xún)?nèi)，或?yàn)闈穸径痉N，或?yàn)閮龈啥痉N。,細(xì)胞培養(yǎng)疫苗有細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)活疫苗兩類(lèi)，前者多以強(qiáng)毒毒株培養(yǎng)增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn)，兩者的制造程序既有相同之處，又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同，所采用的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)方法也有所不同,（一）種毒與毒種繼代,1907年美國(guó)生物學(xué)家Harrison，在無(wú)菌條件下以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達(dá)數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。在隨

25、后的近一個(gè)世紀(jì)里，隨著細(xì)胞生物學(xué)、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法等領(lǐng)城的不斷豐富和完善，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中顯示出強(qiáng)大的潛力。,(二)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn),㈡ 研究的條件可以人為的

26、控制,㈠ 研究的對(duì)象簡(jiǎn)單,㈢ 研究的樣本較均一性,㈣ 研究的內(nèi)容便于觀(guān)察、檢測(cè)和記錄,㈤ 研究的范圍比較廣泛,㈥ 研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì),細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出組織、細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能特性。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件,滲透壓,水的質(zhì)量,營(yíng)養(yǎng)條件,氣體條件,溫度條件,酸堿度,無(wú)菌條件,細(xì)胞培養(yǎng),目前合成培養(yǎng)基的種類(lèi)已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細(xì)胞的生長(zhǎng)而在

27、某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來(lái)的。 目前較為常用的有199培養(yǎng)液、Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等。 合成培養(yǎng)基的主要成份有：氨基酸、維生素、碳水化合物、 無(wú)機(jī)鹽，其它輔助物質(zhì)。,基礎(chǔ)成分,添加成分,血清、抗生素、碳酸氫鈉、緩沖劑等,(二)培養(yǎng)基,生長(zhǎng)液和維持液,(三)細(xì)胞,原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系,由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不

28、能繼續(xù)傳代，或傳代次數(shù)有限,可稱(chēng)為有限細(xì)胞系(finite cell line)， 如可以連續(xù)培養(yǎng)50代以上，則稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞系(continious cell line)。,1. 原代細(xì)胞 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱(chēng)為原代細(xì)胞。傳代細(xì)胞： 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)獲得的細(xì)胞。,原代細(xì)胞的獲?。?用直接從機(jī)體獲得的細(xì)

29、胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)，這種培養(yǎng)過(guò)程主要是采用無(wú)菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代： 原代細(xì)胞初代培養(yǎng)后，可以傳代，但代數(shù)有限，細(xì)胞特性有一定的變化。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。,傳代細(xì)胞是指能在體外連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系，大都數(shù)來(lái)源于癌變細(xì)胞。 傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移

30、，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代。,2.傳代細(xì)胞及培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)相比，培養(yǎng)條件更嚴(yán)格，控制難度更大，其培養(yǎng)方法可概括為：,靜止培養(yǎng)法,懸浮培養(yǎng)法,轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法,細(xì)胞培養(yǎng)方法,固定化培養(yǎng)法,單層貼壁培養(yǎng)法,接種后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面，然后進(jìn)行生長(zhǎng)、分裂繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期。一般數(shù)天就長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)表面，形成

31、致密的單層細(xì)胞。 最后，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)形成二種形態(tài)，成纖維樣型細(xì)胞(fibroblast-like cell type)和上皮樣型細(xì)胞(epithilium-like cell type)。,單層貼壁培養(yǎng)(monolayer anchoraged-dependent culture)是指把細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上進(jìn)行的單層培養(yǎng)方法，這是是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。,旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)是較期培養(yǎng)采用的細(xì)胞培養(yǎng)方法，目前仍用

32、于疫苗等生產(chǎn)。 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)主要優(yōu)點(diǎn)是：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)簡(jiǎn)單，投資少，經(jīng)濟(jì)，可做成支架，大量培養(yǎng)，收獲細(xì)胞或培養(yǎng)液方便，重復(fù)性好，容易放大。表面積增加，處于衡態(tài)轉(zhuǎn)動(dòng)，增加氣體交換。,旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)）,懸浮培養(yǎng)（Suspension culture）是指細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程，主要對(duì)于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞等。 動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，經(jīng)常借鑒發(fā)酵理論和經(jīng)驗(yàn)，但有自

33、身的特點(diǎn)，由于動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性差，在懸浮培養(yǎng)中要注意發(fā)揮動(dòng)物細(xì)胞的特性。 常用的反應(yīng)器有通氣式攪拌混合氣升式生物反應(yīng)器。方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件相對(duì)均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。,懸浮培養(yǎng)法,固定化培養(yǎng)法,固定化培養(yǎng)（immobilization culture）是將動(dòng)物細(xì)胞附著微載體或包埋膠囊內(nèi)，即細(xì)胞固定化后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。適宜于貼壁依賴(lài)性和非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的

34、培養(yǎng)。具有細(xì)胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)首選方法。 吸附法(adsorption method)是通過(guò)物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面的一種固定化方法，如微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)等。雖然吸附法的操作過(guò)程簡(jiǎn)單，但由于相互作用弱，細(xì)胞容易從載體上脫落。,包埋法(entrapment method)是將細(xì)胞包埋在載體內(nèi)部的一種固定化方法，分為網(wǎng)格型和微囊型兩種。網(wǎng)格型的載體為高分子凝膠細(xì)網(wǎng)格，而微囊型的載

35、體為高分子半透膜，直徑為幾至幾百微米，比網(wǎng)格載體小得多。包埋細(xì)胞的高分子材料有人工合成的聚合物、瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等，最常使用的是海藻酸鹽包埋非貼壁細(xì)胞和膠原包埋貼壁細(xì)胞。包埋的機(jī)理是通過(guò)物理作用而實(shí)現(xiàn)的，如1％～2.5％瓊脂糖在高溫加熱下融化，低于45℃～37℃凝固，與細(xì)胞混合，分散在石蠟油中，降低至10℃，得到0.1～0.3 mm微球。,（四）接毒與收獲,病毒接種培養(yǎng)有同步與異步之分，前者在細(xì)胞分裝同時(shí)或不久接種毒種，進(jìn)行培養(yǎng)，

36、如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細(xì)小病毒)；后者在細(xì)胞形成單層后接種毒種，如豬水皰病弱毒細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。通常在細(xì)胞形成單層后傾去培養(yǎng)液，按1%-2%量接種毒種，經(jīng)吸附后加入維持液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%-85%以上細(xì)胞病變時(shí)即可收獲。 病毒培養(yǎng)液收獲時(shí)間和方法依疫苗性質(zhì)而定，可將培養(yǎng)瓶?jī)鋈跀?shù)次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收??；或在病毒增殖培養(yǎng)過(guò)程中可收獲5-7次毒液，細(xì)胞毒液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測(cè)定合格后供配苗用。,