《中國(guó)藥典》薄層色譜的基本要求解析

1、《中國(guó)藥典》薄層色譜的基本要求,周蘭貴州省食品藥品檢驗(yàn)所中藥（民族藥）室 2014年5月,內(nèi)容,薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)《中國(guó)藥典》薄層色譜的基本要求薄層色譜應(yīng)用的影響因素,薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì),薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B），系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，將所得色譜圖與對(duì)照物按同法所得的色譜圖比較，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量

2、測(cè)定的方法。,薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì),薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn)是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達(dá)，為其它色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達(dá)的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多的思考判斷的空間。,提供直觀的彩色圖像是薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn),離線操作的靈活性,各單元操作既有關(guān)聯(lián)，又相互獨(dú)立，點(diǎn)樣器材和方法、展開(kāi)方式、顯色試劑選擇、直觀比較或掃描比較可根據(jù)需要靈活變通。根據(jù)需要操作可以視實(shí)際需要和實(shí)驗(yàn)室條件分層次進(jìn)行和終止，節(jié)省

3、分析時(shí)間和資源。由于是離線操作，所以個(gè)人占機(jī)時(shí)間短。,正相色譜流動(dòng)相（展開(kāi)劑）的廣泛適用性,薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎(chǔ)固定相的正相色譜，有多種組合的有機(jī)溶劑展開(kāi)系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；三氯甲烷系統(tǒng)；己烷系統(tǒng)；正丁醇系統(tǒng)；乙酸乙酯系統(tǒng)等等。酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性。,色譜后衍生的專(zhuān)屬性,色譜后靈活方便的衍生技術(shù)，同一色譜薄層板可生成可見(jiàn)光譜、紫外光譜、熒光淬滅光譜或熒光光譜，給出豐富的檢測(cè)成分的化學(xué)類(lèi)別信息

4、。如三氯化鋁試劑是黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬試劑；碘化鉍鉀是生物堿類(lèi)成分的專(zhuān)屬試劑；三氯化鐵是酚類(lèi)成分的專(zhuān)屬試劑；醋酐硫酸是三萜類(lèi)和甾醇類(lèi)成分的專(zhuān)屬試劑等。硫酸則是許多成分激發(fā)產(chǎn)生熒光的通用試劑，非常方便。,同板多個(gè)樣品平行比較,成本相對(duì)低廉、色譜生成快速、同板可以同時(shí)產(chǎn)生多達(dá)16~18個(gè)樣品色譜，共平行直觀地比較，色彩豐富的圖像給人的視覺(jué)沖擊遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于較為“呆板”的輪廓色譜圖，可以迅速地、粗略地，而且頗為有效地評(píng)價(jià)樣品色譜圖像之間的相試程度。,

5、《中國(guó)藥典》薄層色譜的基本要求,供起草標(biāo)準(zhǔn)用樣品的要求,中成藥薄層色譜鑒別,中藥材薄層色譜鑒別,中藥標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求,,原則,保證用藥安全,科學(xué)、先進(jìn)、規(guī)范、適用,促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際化,中藥標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求,,中藥標(biāo)準(zhǔn)制定《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 研究制定技術(shù)要求,方法學(xué)驗(yàn)證 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則（中國(guó)藥典2010版一部）,供起草用樣品的要求,,研究用樣品應(yīng)具有代表性，覆蓋面要廣，一般至少收集15批以上

6、樣品供研究用；,對(duì)于多來(lái)源品種，每種收集3~5種；相關(guān)信息包括：產(chǎn)地（如有可能表明野生或家種）、收集地、收集時(shí)間、收集人,獨(dú)家生產(chǎn)的應(yīng)不少于10批，多家企業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)盡量收集每家企業(yè)的樣品，5家以上企業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)至少收集5~10家企業(yè)生產(chǎn)的樣品,樣品量除滿足起草研究、留樣觀察外，還應(yīng)有不少于3倍檢驗(yàn)量的樣品供復(fù)核用,,,供起草用樣品的要求,,注意,中藥材、飲片要求專(zhuān)家鑒定,對(duì)于具有多種不同規(guī)格的中成藥，應(yīng)收齊全部規(guī)格的樣品,試驗(yàn)用樣

7、品必須采用合格原輔料依法生產(chǎn)的樣品，收集的每批樣品均要有該企業(yè)的原輔料和成品的自檢報(bào)告及詳細(xì)生產(chǎn)工藝,供起草用樣品的要求,,陰性對(duì)照樣品,生產(chǎn)單位應(yīng)盡可能提供,研究單位自制,陰性樣品系指按處方除去被測(cè)定的藥味，按制法制備的樣品，注意應(yīng)包括所有的輔料和工藝步驟，制成量應(yīng)與原標(biāo)準(zhǔn)相符,,,鑒別,,,鑒別,顯微鑒別,理化鑒別,色譜鑒別,特征圖譜鑒別,一般理化鑒別,熒光鑒別,光譜鑒別,薄層色譜鑒別,液相色譜鑒別,氣相色譜鑒別,,,,中藥材

8、薄層色譜鑒別,,盡量采用對(duì)照品和對(duì)照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r(shí)進(jìn)行對(duì)照,圖譜清晰、斑點(diǎn)明顯、分離度與重現(xiàn)性符合要求,根據(jù)被測(cè)物的特性選擇合適的固定相、展開(kāi)劑及顯色方法等色譜條件,色譜條件的優(yōu)化應(yīng)對(duì)三個(gè)以上的展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行考察,確定供試品取樣量、提取和純化方法、點(diǎn)樣量等條件,選擇合適的對(duì)照物質(zhì)，確定對(duì)照物質(zhì)用量、濃度、溶劑、點(diǎn)樣量等,,,,中藥材薄層色譜鑒別,驗(yàn)證,專(zhuān)屬性,重復(fù)性,耐用性,重現(xiàn)性,多來(lái)源藥材、飲片的色譜行為是否一致混淆品的

9、區(qū)別斑點(diǎn)是否重疊,不同品牌的薄層板或自制薄層板考察考察至少2~3個(gè)品牌或廠家的薄層板，,不同溫度、濕度考察，在5℃~35℃考察高低2個(gè)溫度；在低相對(duì)濕度（RH）15~30%和高相對(duì)濕度75~90%各考察一個(gè)相對(duì)濕度,,,,,中成藥薄層色譜鑒別,（1）薄層色譜具有分離與鑒別的特性，并具有直觀、承載信息大、專(zhuān)屬性強(qiáng)、快速、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是中成藥鑒別的首選方法。,（2）新建立的薄層色譜應(yīng)該圖譜清晰，斑點(diǎn)明顯，分離度、專(zhuān)

10、屬性、重現(xiàn)性與耐用性符合要求，并需要提供圖譜；,（3）應(yīng)盡量與該藥材和飲片的薄層色譜鑒別方法一致，如因其他成分干擾或制劑的提取方法不同，可增加提取純化處理或展開(kāi)劑優(yōu)化。,新增薄層色譜鑒別要求,,供試品溶液的制備：應(yīng)盡可能除去干擾，同時(shí)方法盡量簡(jiǎn)便，首先進(jìn)行提取、純化選擇，如回流、超聲提取方法，溶劑、時(shí)間，酸堿處理，溶劑萃取，柱子純化等的選擇,對(duì)照品選擇：盡量采用以對(duì)照品和對(duì)照提取物或?qū)φ账幉耐瑫r(shí)進(jìn)行對(duì)照。當(dāng)對(duì)照品不易獲得時(shí)，可采

11、用對(duì)照提取物或?qū)φ账幉臑閷?duì)照,薄層板的選擇：吸附劑的比較，選硅膠G板還是GF254板,,新增薄層色譜鑒別要求,點(diǎn)樣量選擇：不同點(diǎn)樣量的比較,展開(kāi)劑選擇：對(duì)三個(gè)以上的展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行考察比較,顯色條件選擇：日光、紫外光、顯色劑,陰性空白試驗(yàn)：以證明其他藥味無(wú)干擾,耐用性：不同廠牌的薄層板、溫度、相對(duì)濕度等,注意,（1）使用對(duì)照藥材應(yīng)保證藥材的主斑點(diǎn)在樣品中均有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)（可參照制法對(duì)藥材進(jìn)行前處理），供試品色譜中不能只有對(duì)照藥材色譜中的1~

12、2個(gè)次要斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng),（2）盡可能采取一個(gè)供試液多項(xiàng)多維鑒別使用的薄層色譜方法，達(dá)到節(jié)約資源、保護(hù)環(huán)境、簡(jiǎn)便實(shí)用的目的,（3）注意”過(guò)柱“的影響，不同品牌、不同批號(hào)的吸附劑吸附能力有的不同,（4）對(duì)原方法的驗(yàn)證注意原標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣量按手鋪板制定，現(xiàn)用市售薄層板點(diǎn)樣量過(guò)大分離度差，點(diǎn)樣量可減少,薄層色譜應(yīng)用的影響因素,樣品預(yù)處理薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)吸附劑活性溶劑蒸汽在薄層色譜中的應(yīng)用溫濕度對(duì)薄層色譜的影響薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開(kāi)

13、劑）的選擇薄層板,樣品預(yù)處理,要得到一個(gè)較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試品溶液得以?xún)艋且粋€(gè)重要的有時(shí)甚至是關(guān)鍵的步驟提取溶劑的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸點(diǎn)適中,供試品溶液凈化的方法,（1）單一溶劑提取法 根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的化學(xué)特性，有選擇性地采用某種溶劑直接提取制備。（如浙貝母、平貝母、華山參、洋金花等）（2）分段提取法； 被檢測(cè)樣品不同極性部位分別提取后制成相應(yīng)供試液，分別檢測(cè)分析（如丹參）

14、（3）特殊提取方式 如蜜丸等含糖較高又有黏性的樣品，有機(jī)溶劑較難滲透到樣品的內(nèi)部，可加硅藻土、滑石粉等分散劑共同研勻后再提取。,供試品溶液凈化的方法,（4）液-液萃取法 利用樣品與雜質(zhì)在兩相（水相和有機(jī)相）中溶解度的不同，達(dá)到凈化目的。 特別適合合劑、口服液、糖漿劑、注射劑等的處理。（5）固-液萃取法 固相小柱萃取基本上是基于吸附、鍵合相分配、正相、反相、離子對(duì)、離子交換原理富集待測(cè)成分，去除部分雜質(zhì)。,點(diǎn)

15、樣,點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣？ 點(diǎn)狀點(diǎn)樣： 簡(jiǎn)單快速 缺點(diǎn)：接觸式點(diǎn)樣，易損傷薄層板表面 點(diǎn)樣量小 斑點(diǎn)容易點(diǎn)大，易產(chǎn)生容積環(huán)形色譜效應(yīng)，影響 分離效果 條帶狀點(diǎn)樣 優(yōu)點(diǎn)：一般噴霧式，不損傷薄層板表面 點(diǎn)樣量比點(diǎn)狀點(diǎn)樣大 原點(diǎn)不會(huì)上下擴(kuò)散，分離度增加,點(diǎn)樣,點(diǎn)多少？ 常規(guī)的TLC：0.5-5μl， 高效TLC：HPTLC： ＜ 1μ

16、l；用什么點(diǎn)？ 常規(guī)：手工一般使用定量毛細(xì)管（0.5/1/2和5μl），點(diǎn)樣是毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/ HPTLC板面，（玻璃毛細(xì)管不易損傷預(yù)制板的板面），切忌斑點(diǎn)或條帶在原點(diǎn)因溶劑過(guò)大造成原點(diǎn)的擴(kuò)散，一般建議控制在5μl以下。 裝置：手工點(diǎn)樣器 半自動(dòng)點(diǎn)樣器 全自動(dòng)點(diǎn)樣器,展開(kāi)-展開(kāi)溶劑,使用的溶劑必須是“分析

17、純”或“色譜純”有毒試劑如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否則許多鑒別無(wú)法進(jìn)行，有的例子是難以取代的）；溶劑組成采用體積比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或?qū)懽?0:20:1 V/V/V)。甲酸一般雖然用量很微，但應(yīng)準(zhǔn)確加入。溶劑總量應(yīng)足以使薄層板的浸入深度約為5mm（展開(kāi)劑量的多少會(huì)影響斑點(diǎn)的Rf值）展開(kāi)劑要求新鮮配制，一般不用多次反復(fù)使用，如展開(kāi)溶劑混合放置后有分層現(xiàn)象，則按要求放置分層后取需

18、要的一相（上層或下層），備用。,展開(kāi)-飽和與預(yù)平衡,溶劑的蒸氣相在展開(kāi)缸中也參與色譜展開(kāi)而形成三維的層析過(guò)程，即固相-板上的吸附劑、液相-展開(kāi)劑、氣相-溶劑蒸氣三相相互作用；如處理不好，會(huì)產(chǎn)生如下現(xiàn)象： 展開(kāi)過(guò)程中展開(kāi)劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿。 未平衡或平衡時(shí)間不夠易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。,該怎樣飽和呢？,展開(kāi)缸預(yù)平衡或飽和：展開(kāi)前將展開(kāi)劑置展開(kāi)缸中，其蒸氣在展開(kāi)缸中平衡一段時(shí)間（15-20min）后迅速放入薄層板展

19、開(kāi)；預(yù)吸附：將薄層板放在展開(kāi)缸中，不與展開(kāi)劑接觸，吸附一定量的溶劑蒸氣可以改變層析行為，得到不同的色譜；,飽和方式,方法A（展開(kāi)缸、薄層板均不飽和）方法B（展開(kāi)缸飽和、薄層板不飽和）方法C（展開(kāi)缸、薄層板均飽和）,展開(kāi)-展開(kāi)劑優(yōu)化,展開(kāi)劑在色譜展開(kāi)中起著關(guān)鍵作用，至今植物藥分析的薄層展開(kāi)劑的優(yōu)化基本上還是依靠經(jīng)驗(yàn)。主要是因?yàn)橹参锼幒刑嗟奈粗煞?，色譜行為各不相同，所以試錯(cuò)法仍然是中藥分析實(shí)驗(yàn)室在選擇展開(kāi)劑時(shí)最常用的方法（包括借

20、鑒他人的經(jīng)驗(yàn)）,展開(kāi)劑的優(yōu)化,主要考慮兩方面：溶劑的極性和溶劑的選擇性。 前者要求使待分離的主要物質(zhì)的Rf值在0.3~0.7之間；當(dāng)Rf值符合要求后，進(jìn)行等強(qiáng)度溶劑替換，直到分離度達(dá)到要求為止。對(duì)于硅膠等吸附薄層和正相分配色譜來(lái)說(shuō)，展開(kāi)劑的極性越大，溶劑強(qiáng)度就越大，洗脫能力就越強(qiáng)，即同一物質(zhì)在薄層板上的Rf值越大。根據(jù)文獻(xiàn)和樣品所含化合物類(lèi)型選擇，并記錄色譜純?nèi)軇鰷p溶劑強(qiáng)度→混合，改性試劑，添加酸堿、水等→獲得最佳配比,

21、常用溶劑的極性順序,水（最大）＞ 甲酰胺＞乙腈＞甲醇＞乙醇 ＞丙醇＞丙酮＞二氧六環(huán)＞四氫呋喃＞甲乙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞異丙醚＞二氯甲烷＞三氯甲烷＞溴乙烷＞笨＞四氯化碳＞二硫化碳＞環(huán)己烷＞己烷＞煤油（最小）,展開(kāi)-展開(kāi)距離,是不是展距越大越好呢？ TLC:12-15cm HPTLC:5-7cm建議對(duì)展距進(jìn)行考察，選擇最佳展距，并做好記錄,溫度對(duì)薄層色譜的影響,一般而言，溫度越低，Rf值越低；

22、展開(kāi)溫度對(duì)薄層色譜的影響不大，一般相差±5℃時(shí)，Rf值的變動(dòng)一般不會(huì)超過(guò)±0.02；因此，展開(kāi)溫度一般控制在15~25 ℃之間即可（一般空調(diào)實(shí)驗(yàn)室均能解決）；記錄試驗(yàn)時(shí)的實(shí)際溫度。,相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜的影響,一般而言，濕度越低， Rf值越低；相對(duì)濕度是影響薄層色譜重現(xiàn)性差的主要原因之一；不同樣品或成分和所選用的展開(kāi)劑對(duì)相對(duì)濕度的適應(yīng)能力不同；因此，建議展開(kāi)的濕度一般控制在＜50%記錄試驗(yàn)時(shí)實(shí)際的相對(duì)濕度

23、,相對(duì)濕度的控制方法,顯色,對(duì)同一薄層板在UV254、365nm、可見(jiàn)光（衍生前和/或后）下觀察——給出豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型信息；TLC板上常含有UV指示劑（F-254），在UV254nm激發(fā)下產(chǎn)生有色熒光。對(duì)UV254nm有吸收的物質(zhì)存在于斑點(diǎn)上時(shí)發(fā)射的熒光會(huì)減弱（熒光淬滅）；噴霧 優(yōu)點(diǎn)：快速、方便、試劑消耗少； 缺點(diǎn)：會(huì)產(chǎn)生有毒霧氣，重現(xiàn)性是個(gè)問(wèn)題。浸漬 優(yōu)點(diǎn)：顯色均勻 缺點(diǎn)：試劑

24、消耗量大，產(chǎn)生溶劑線，背景染色深；,顯色劑考察,對(duì)顯色劑考察原則： 用對(duì)照品對(duì)照的樣品，通常選用針對(duì)對(duì)照品的專(zhuān)屬性顯色劑，如生物堿類(lèi)藥材，選用改良碘化鉍鉀試液； 用對(duì)照藥材對(duì)照的樣品，通常選用顯色劑如10%硫酸乙醇溶液顯色；或選用針對(duì)該樣品活性成分或?qū)傩猿煞值膶?zhuān)屬性顯色劑。加熱顯色者須注意加熱的時(shí)間和溫度（做好時(shí)間和溫度的記錄）有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時(shí)間長(zhǎng)短不同或放置時(shí)間不