中國(guó)藥典版二部色譜法概況

1、1,中國(guó)藥典2010年版二部色譜法概況,2010年8月,想了解……,色譜法總體要求有變化嗎？——儀器要求改了嗎？——操作要求改了嗎？——判斷標(biāo)準(zhǔn)改了嗎？品種標(biāo)準(zhǔn)中有對(duì)色譜法的新要求嗎？——新增要求控制？——修訂原有方法？新要求帶來影響……,主要內(nèi)容,色譜法的基本概念 色譜法在中國(guó)藥典中的沿革 中國(guó)藥典2010年版色譜法內(nèi)容概況 展望,何為色譜法,色譜法是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異(吸附力、溶解度、分子形狀

2、和大小、分子極性、分子親和力等)，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相叫固定相，另一相流過此固定相叫作流動(dòng)相。由于各組分受流動(dòng)相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力的不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，使得結(jié)構(gòu)上只有微小差異的各組分得到分離。再配合相應(yīng)的光學(xué)、電學(xué)、電化學(xué)和或其他相關(guān)檢測(cè)手段，對(duì)各組分進(jìn)行定性和定量分析的方法。,,色譜法的基本概念,,色譜法的基本概念,分離原理吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法 排阻色譜法

3、,分離方法紙色譜法薄層色譜法柱色譜法 高效液相色譜法氣相色譜法,,色譜法的基本概念,特點(diǎn)分辨效力分析效率靈敏度操作及應(yīng)用,局限性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu),色譜法在中國(guó)藥典中的沿革,V A 紙色譜法(1985)V B 薄層色譜法(1985)V C 柱色譜法(1985) V D 高效液相色譜法(1985)V E 氣相色譜法(1985)V F 電泳法(1990)V G 毛細(xì)管電泳法(2000)V H 分子排阻色譜法

4、(2000)V J 離子色譜法(2010),高效液相色譜法在中國(guó)藥典二部的應(yīng)用,中國(guó)藥典2010年版色譜法內(nèi)容概況,V A 紙色譜法V B 薄層色譜法V C 柱色譜法V D 高效液相色譜法V E 氣相色譜法V F 電泳法(1990)V G 毛細(xì)管電泳法(2000)V H 分子排阻色譜法(2000)V J 離子色譜法(2010),V A 紙色譜法,系以紙為載體，紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相，用展開劑進(jìn)行展開的分配色譜。

5、,鑒別 純度檢查 含量測(cè)定,V B 薄層色譜法,系將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，經(jīng)展開、檢視后所得的色譜圖，與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖作對(duì)比，用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查的方法。,V B 薄層色譜法,儀器與材料薄層板(增 “高效薄層板的粒徑一般為5~7µm”)點(diǎn)樣器展開容器顯色劑(“碘蒸氣中顯色”修改為“適宜試劑的蒸氣中熏蒸顯色”)顯色裝置檢視裝置,V B 薄層色譜法,操作方法薄層板制備 ( 110℃活化30

6、分鐘)點(diǎn)樣 (點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，點(diǎn)樣直徑為2~4mm(高效薄層板為1~2mm) ，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜，一般為1.0~2.0cm (高效薄層板可不小于5mm) )展開(“待展開至規(guī)定距離(一般為10~15cm)”調(diào)整為“待展開至適宜的展距(如：20cm的薄層板，展距一般為10~15cm；10cm的高效薄層板，展距一般為5cm左右)”顯色與檢視,V B 薄層色譜法,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)檢測(cè)靈敏度 ( 系指雜質(zhì)

7、檢查時(shí)，供試品溶液中被測(cè)物能被檢出的最低量。)比移值(Rf) (除另有規(guī)定外，比移值(Rf)應(yīng)在0.2~0.8之間。 )分離效能 (鑒別時(shí)，在對(duì)照品與結(jié)構(gòu)相似藥物的對(duì)照品制成的混合溶液；雜質(zhì)檢查時(shí)，雜質(zhì)對(duì)照品用供試品自身稀釋對(duì)照溶液溶解、用待測(cè)組分的對(duì)照品溶液溶解、供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液。 應(yīng)顯示兩個(gè)清晰分離的斑點(diǎn))”,V B 薄層色譜法,測(cè)定法鑒別 (同濃度對(duì)照品溶液、供試品溶液與對(duì)照品溶液等體積混合)雜質(zhì)檢查

8、(雜質(zhì)對(duì)照品法、供試品溶液的自身稀釋對(duì)照法、或兩者并用 。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)采用系列自身稀釋對(duì)照溶液時(shí)，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量),煙酰胺P856,V B 薄層色譜法,1　　2　　 3　　 41、煙酰胺溶液　2、煙酸溶液　3、堿破壞溶液　4、混合溶液,,V C 柱色譜法,吸附柱色譜 分配柱色譜,V D 高效液相色譜法,系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的方法。注入的供試品

9、，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。,V D 高效液相色譜法,(1) 色譜柱反相 (非極性:C18、C8、CN、NH2)(組分的出峰順序：極性大的先出峰，極性小的后出峰。 )正相 (極性：硅膠)主要用于分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物(極性：固定相>流動(dòng)相)離子交換分子排阻對(duì)映異構(gòu)體,V D 高效液相色譜法,(1) 色譜柱除另有規(guī)定外，普通分

10、析柱的填充劑粒徑一般在3~10µm之間，粒徑更小(約2µm)的填充劑常用于填裝微徑柱(內(nèi)徑約2mm)。使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。,V D 高效液相色譜法,(2) 檢測(cè)器選擇性 紫外、熒光、電化學(xué)通用型 蒸發(fā)光散射、示差折光,V D 高效液相色

11、譜法,(3) 流動(dòng)相反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)(采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，首選乙腈-水系統(tǒng))，如經(jīng)使用不合適時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。其中，調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，以組分比例較低者(小于或等于50%)相對(duì)于自身的改變量不超過±30%且相對(duì)于總量的改變量不超過±10%為限，如30% 相對(duì)改變量的數(shù)值超過總量的10%時(shí)，則改變量以總

12、量的±10%為限 。,V D 高效液相色譜法,系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論板數(shù) 分離度 重復(fù)性 拖尾因子,V D 高效液相色譜法,測(cè)定法 內(nèi)標(biāo)法 外標(biāo)法 加校正因子的主成分自身對(duì)照法 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法 面積歸一化法,司帕沙星P221,消旋山莨菪堿P866,硫酸卡那霉素P967,氨基糖苷類抗生素,蒸發(fā)光散射檢測(cè)法,阿米卡星P388,柱前衍生化法,V E 氣相色譜法,系采用氣體為流動(dòng)相(載氣)流經(jīng)裝

13、有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。,V E 氣相色譜法,載氣源進(jìn)樣部分色譜柱柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),V E 氣相色譜法,V E 氣相色譜法,各品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件，除檢測(cè)器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、載體牌號(hào)、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均

14、可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于30分鐘內(nèi)記錄完畢。,V E 氣相色譜法,測(cè)定法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法面積歸一化法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法 (當(dāng)采用頂空進(jìn)樣時(shí)，由于供試品和對(duì)照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果為準(zhǔn)。),對(duì)于生產(chǎn)過程中引入的有機(jī)溶劑，應(yīng)在后續(xù)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)予以有效去除。除正文已明確列有“殘留溶劑”檢

15、查的品種必須依法進(jìn)行該項(xiàng)檢查外，其他未在“殘留溶劑”項(xiàng)下明確列出的有機(jī)溶劑與未在正文中列有此項(xiàng)檢查的品種，如生產(chǎn)過程中引入或產(chǎn)品中殘留有機(jī)溶劑，均應(yīng)按附錄“殘留溶劑測(cè)定法”檢查并應(yīng)符合相應(yīng)溶劑的限度規(guī)定。（凡例 十七）,V E 氣相色譜法,頭孢泊肟酯P198殘留溶劑,V F 電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠)中，在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)

16、行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜并計(jì)算其含量的方法。,V G 毛細(xì)管電泳法,是指以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)供試品中各組分的淌度(單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度)和(或)分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)各組分分離的一種分析方法。,鹽酸頭孢吡肟P671,V H 分子排阻色譜法,是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。,頭孢拉定P1

17、95,V J 離子色譜法,系采用高壓輸液泵系統(tǒng)將規(guī)定的洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離的色譜分析方法。注入的供試品由洗脫液帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后，經(jīng)過抑制器或衍生系統(tǒng)進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。,一、離子色譜的基本原理,44,生命至上 技澤天下,45,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,46,生命至上 技澤天下,淋洗液在線發(fā)生器——不用化學(xué)試劑，只用水（RFIC）環(huán)保：不直接接觸化學(xué)試劑使

18、用方便：只用水和鼠標(biāo)，省時(shí)省力 重現(xiàn)性好：消除試劑雜質(zhì)的干擾、配制溶液的誤差和操作誤差，結(jié)果更可靠。 增加IC的應(yīng)用效能，提高靈敏度和分離度，改善重現(xiàn)性，擴(kuò)展應(yīng)用，優(yōu)良的不同時(shí)間和不同實(shí)驗(yàn)室之間的可比性。普通等濃度泵即可作梯度淋洗，梯度淋洗和等濃度淋洗同樣簡(jiǎn)單方便，延長(zhǎng)泵的使用壽命。,47,生命至上 技澤天下,檢測(cè)方式電導(dǎo) 檢測(cè)具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測(cè)器離子色譜最常用的檢測(cè)器􀂊安培法

19、在特定的條件下可對(duì)某些化合物直接進(jìn)行氧化還原反應(yīng)􀂊紫外－可見光度法􀂃紫外直接吸收或可見光光度法測(cè)定選擇性強(qiáng)􀂃可進(jìn)行柱后衍生熒光法􀂃HPLC􀂊質(zhì)譜,48,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,49,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,50,生命至上 技澤天下,一、離子色譜技術(shù)的基本原理,51,生命至上 技澤

20、天下,樣品的前處理,0.22，0.45um濾膜——去除顆粒狀雜質(zhì)C18預(yù)處理小柱、On-Guard RP柱——去除有機(jī)分子石墨化碳黑柱——去除色素On-Guard P柱——去除土壤中腐殖酸、苯環(huán)類的化合物On-Guard H、Na柱——去除溶液中的金屬離子On-Guard Ag柱——去除溶液中的Cl-離子，主要測(cè)定高氯（海水）物質(zhì)中的NO2-，NO3-等離子在線／離線除糖——氨基酸樣品分析時(shí)，除去糖對(duì)氨基酸檢測(cè)時(shí)的干擾,52

21、,生命至上 技澤天下,離子色譜法應(yīng)用,53,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,54,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,55,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,56,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,57,生命至上 技澤天下,三、離子色譜在藥品分析中的應(yīng)用,58,生命至上 技澤天下,59,生命至上 技澤天下,帕米膦酸二鈉注射液,三、離子色譜在藥品分析中