無菌檢查法 中國藥典2015年版四部

1、1101無菌檢查法中畫藥典2015年版1100生物檢查法1101無菌檢查法無菌檢查法系用于檢査藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌檢查應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗環(huán)境必須達(dá)到無菌檢査的要求，檢驗全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥

2、工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌的培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可按以下處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或成品培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

3、制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2?25C、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。1.硫乙酵酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪胨15_0g氣化鈉2.5g酵母浸出粉5.0g新配制的0.1%刃天無水葡萄糖5.0g青溶液1.0mlL胱氨酸0.5g瓊脂0.75g硫乙醇酸鈉0.5g水1000ml(或硫乙醇酸）（0_3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加人葡萄糖和刃天青

4、溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為7.1土0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的12。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的15，否則，須經(jīng)100C水浴加熱至粉紅色消失（不釋過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35C培養(yǎng)。2.胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g氣化鈉5.0g大豆

5、木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖無水葡萄糖2.5g2.3g水1000ml除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在2VC的pH值為7.30.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置20?251培養(yǎng)。3.中和或滅活用培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。4.0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基

6、(用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）胨10.0g氣化鈉5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml葡萄糖5.Og除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為7.2士0.2，分裝，滅菌。5.胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨15.0g瓊脂15.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g水1000ml氣化鈉5.0g除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH

7、值為7_3士0.2，加人瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。6.沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物水1000ml和胰酪胨等量混合物10.0g葡萄糖20.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為5.6士0.2，加人葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。7.沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物瓊脂15.0g和胰酪胨等量混合物10.0g水1000ml葡萄糖40.0g除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微

8、溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為5.6士0.2，加人瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。培養(yǎng)基的適用性檢査136?1101無菌檢查法中國藥典2015年版無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物無毒性。檢驗數(shù)量檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量，成品每亞批均應(yīng)進(jìn)行無菌檢査。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗按表2規(guī)定。表1、表2中最少檢驗數(shù)量

9、不包括陽性對照試驗的供試品用量。檢驗量是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g或ml)。除另有規(guī)定外，供試品檢驗量按表3規(guī)定。若每支(瓶)供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩種培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品

10、以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗，加菌量小于lOOcfu，供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)72小時內(nèi)應(yīng)生長良好。陰性對照供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。供試品處理及接種培養(yǎng)基操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒，如果供試品容器內(nèi)

11、有一定的真空度，可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)人無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。除另有規(guī)定外，按下列方法進(jìn)行供試品處理及接種培養(yǎng)基。1.薄膜過濾法薄膜過濾法一般應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢査用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜6油類供試品，其濾膜和過濾器在使用

12、前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。水溶液供試品取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗。除生物制品

13、外，一般樣品沖洗后，1份濾器中加人100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器中加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。生物制品樣品沖洗后，2份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器中加人100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。水溶性固體供試品取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。非水溶性供試品取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于適量含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0_1

14、%?1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。加人含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)基照水溶液供試品項下的方法操作?？扇苡谑耐樗岙惐サ囊釀┖宛ば杂蛣┕┰嚻啡∫?guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當(dāng)加熱，但溫度不得超過44C趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加人不少于100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜

15、沖洗及接種培養(yǎng)基照非水溶性制劑供試品項下的方法操作。無菌氣（噴）霧劑供試品取規(guī)定量，將各容器置一20C或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出，以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中混合，供試品亦可采用其他適宜的方法取出。然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。裝有藥物的注射器供試品取規(guī)定量，將注射器中的內(nèi)容物（若需要可吸人稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適宜稀釋液的無菌

16、容器中，然后照水溶液或非水溶性供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品取規(guī)定量，每個最小包裝用50?100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢査。2.直接接種法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢査的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和

17、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相等；生物制品無菌檢査時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)為2:1。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢査時，培養(yǎng)基的用量和髙度同方法適用性試驗。O無菌十四烷酸異丙酯的制備采用薄膜過濾法