2015版中國藥典檢驗操作規(guī)程

1、2015年版藥典,微生物檢驗規(guī)程,1.1無菌操作要求,1.1.1 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。 1.1.2專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。 1.1.3 接種樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?1.1無菌操作要求,1.1.4 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次

2、后使用。 1.1.5 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。,1.1無菌操作要求,1.1.6 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈旁操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞（即硅氟膠塞）都要通過火焰消毒。 1.1.7 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。 1.1.8 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直

3、接用口吸。,1.2無菌間使用要求,1.2.1 無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品。   1.2.2無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。,1.3消毒滅菌要求1.3.1滅菌前準(zhǔn)備,1.2.3處理和接種樣

4、品時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。（1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶，內(nèi)容物不應(yīng)超過總體積的2/3（例如500mL的三角瓶最好裝300～350mL培養(yǎng)基，以防再次加熱融化時爆沸）。（3）無菌室內(nèi)使用的毛巾、脫脂棉球用紙包裹，進行濕熱滅菌。,1.3.2裝放,（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。（2）

5、大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。,1.3.3設(shè)備檢查,（1）檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。（2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。（3）對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。,1.3.4滅菌處理,(1) 干熱滅菌法：用于玻璃器皿、

6、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60℃以下才能打開箱門。(2)立式壓力蒸氣滅菌器：待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下 再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。,（3）物品取出,,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉、包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達

7、到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應(yīng)廢棄。取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。,1.4有毒有菌污物處理要求,1.4.1經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌（經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃30min高壓滅菌）。1.4.2染菌后的

8、吸管（即進行陽性菌操作后的），使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)121℃30 min高壓滅菌。,有毒有菌污物處理要求,1.4.3涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，強致病菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。1.4.4打碎的培養(yǎng)物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸

9、液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。,有毒有菌污物處理要求,1.4.5污染的工作服或進行強致病菌試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。      1.5培養(yǎng)基制備要求1.5.1根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱?。筛鶕?jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進行），然后溶于蒸餾水中，在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進行質(zhì)量檢驗。1.5.2因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的P

10、H降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。,有毒有菌污物處理要求,1.5.3盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器（三角燒瓶）為好。1.5.4每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗（空白平皿試驗）及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。,2.實驗操作,2.1準(zhǔn)備用具，配制培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)箱2.1

11、.1用具：150mL三角燒瓶 試管 1mL移液管 10mL移液管 2.1.2培養(yǎng)基：需氧菌菌總數(shù) 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、霉菌和酵母菌總數(shù) 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基控制菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基接種平板 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基麥康凱

12、瓊脂培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基,實驗操作,2.1.3稀釋液：0. 9%無菌氯化鈉溶液2.1.4培養(yǎng)箱：3個（30?35℃、20?25℃、42?44℃）2.2培養(yǎng)基配制2.3滅菌2.4無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24至48小時，以檢查滅菌是否徹底。2.5無菌室準(zhǔn)備：用消毒液擦拭無菌室，將本次試驗所用的器皿、培養(yǎng)基通過傳遞窗送到無菌室，，樣品置于傳遞窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于緩沖間。

13、開啟凈化系統(tǒng)1小時，關(guān)閉凈化系統(tǒng)，打開紫外燈0.5小時，關(guān)閉紫外燈，至少0.5小時后進入無菌室。,2.6微生物計數(shù)檢驗（平皿傾注法）,2.6.1供試液制備2.6.1.1稱取樣品：一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑為100cm2; 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時，應(yīng)從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4 丸，膜劑還不得少于4 片。2.6.1.2稀釋液制備：0. 9%無菌氯化鈉溶液,Title

14、and content layout (Text page),2.6.2平皿的制備：3個稀釋級（常用10-1、10-2、10-3）（每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個平板），同時做空白（等量稀釋劑）〖供試液用量為適應(yīng)性試驗確定的，常用1ml〗2.6.3加入培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至45℃左右，傾入已加入供試液的平皿中，每個平皿約15mL（即傾倒時液面剛剛閉合時），在超凈臺面上輕輕晃動使供試液均勻混合于培養(yǎng)基中，放置一旁待冷卻凝固

15、。,2.6.4培養(yǎng)：,待平皿完全冷卻凝固，通過傳遞窗取出，倒置疊放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時間及溫度：需氧菌菌總數(shù) 30?35℃培養(yǎng)3?5 天霉菌和酵母菌總數(shù) 20?25℃培養(yǎng)5?7 天，,2.7控制菌檢驗,2.7.1供試液制備：取供試品10g，用稀釋劑制成1 : 10供試液，混勻，在20?25℃培養(yǎng)約2小時(可以在無菌室中先做這一步，等其余試驗步驟完成，再繼續(xù)進行控制菌的下一步)。耐膽鹽革蘭陰性菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基大腸

16、埃希氏菌 0. 9%無菌氯化鈉溶液沙門菌 直接取樣品10g或10ml,2.7.2預(yù)培養(yǎng)（增菌培養(yǎng)）：,取供試液10mL（相當(dāng)于1g樣品），加在 ml增菌液體培養(yǎng)基（經(jīng)方法適用性試驗確定）中，30?35℃培養(yǎng)24?48小時。耐膽鹽革蘭陰性菌 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙門菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,2.7.3選擇和分離培養(yǎng)

17、,2.7.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌：取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001tnl) 供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30?3 5℃培養(yǎng)24?4 8小時。2.7.3.2大腸埃希氏菌：l ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42?44℃培養(yǎng)24?4 8小時。,選擇和分離培養(yǎng),2.7.3.3沙門菌：0.1 ml接種至10mlRV沙門增

18、菌液體培養(yǎng)基中，30?35℃培養(yǎng)18?2 4小時。2.7.4平板劃線分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基平板的準(zhǔn)備：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50℃左右，傾入滅菌平皿中，每個平皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培養(yǎng)基。耐膽鹽革蘭陰性菌 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門菌 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基,（2）各種物品的準(zhǔn)備,取出預(yù)培養(yǎng)后的控制菌供試液，置于工作臺上；接

19、種前準(zhǔn)備好酒精燈、一次性接種針、火柴、酒精棉球、試管架等?？稍陉栃跃一驘o菌室操作，無菌室準(zhǔn)備工作相同。（3）平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30°角，以便劃線。,Title and content layout (Text page),右手握一次性接種針，把接種針上的菌液涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次

20、劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個菌落，以便進行純培養(yǎng)。,Title and content layout (Text page),2.7.4培養(yǎng)：接種后的平板倒置疊放置于培養(yǎng)箱中，30?35℃培養(yǎng)18?24小時。2.8培養(yǎng)物的觀察2.8.1需氧菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時點計。2.8.2霉菌和酵母

21、菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時點計。2.8.3大腸埃希菌：每天觀察菌落的生長情況。2.8.4沙門氏菌：菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。如有疑似菌落則用接種針挑選于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18?2 4小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。,3.數(shù)據(jù)報告,3.1平皿法：點計平板上生長的所有菌落數(shù)，計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的

22、平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。,3.2控制菌,3.2.1耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查l g 或lm l供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。3.2.2大腸埃希菌：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌

23、；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。,3.2.3沙門菌：,若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢

24、出沙門菌。,Title and content layout (Text page),3.3報告規(guī)則：需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于l00cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。取最髙的平均菌落數(shù)，計算lg 、lmL或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時，以< 1 乘以

25、最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。3.4結(jié)果判斷：10 cfu：可接受的最大菌數(shù)為20100cfu：可接受的最大菌數(shù)為2001000cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000，依此類推,Title and content layout (Text page),3.5限度標(biāo)準(zhǔn)：3.5.1不含中藥原粉的口服中藥制劑：需氧菌總數(shù) 103cfu（≤2000） 102cfu（≤200）霉菌和酵母菌總數(shù) 102

26、cfu（≤200） 101 cfu（≤20）大腸埃希菌 不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出3.5.2含中藥原粉的口服中藥制劑3.5.2.1不含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù) 104cfu（≤20000） 5×102cfu（≤1000）霉菌和酵母菌總數(shù) 102cfu（≤200） 102 cfu（≤20）大腸埃希菌 不

27、得檢出,Title and content layout (Text page),沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 ＜1003.5.2.2含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù) 105cfu（≤200000） 103cfu（≤2000）霉菌和酵母菌總數(shù) 5×100cfu（≤1000） 100 cfu（≤200）大腸埃希菌 不得檢出

28、沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 ＜10,4.實驗時間安排,4.1第一天：準(zhǔn)備用具、培養(yǎng)基、稀釋劑，滅菌4.2第二天：準(zhǔn)備無菌室（預(yù)計2小時），檢驗（無菌室操作預(yù)計3小時），平皿冷卻（夏季預(yù)計2小時，冬季預(yù)計1小時），移出無菌室進行培養(yǎng)（預(yù)計0.5小時）4.3第三天：觀察培養(yǎng)物（需氧菌菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)第一天），耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門氏菌的預(yù)培養(yǎng)結(jié)束，進行分離培養(yǎng)操作，準(zhǔn)備培養(yǎng)基平板

29、。,Title and content layout (Text page),4.4第四天：觀察培養(yǎng)物（需氧菌菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)第二天），耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)束，進行接種劃線操作。4.5第五天：觀察培養(yǎng)物（霉菌和酵母菌總數(shù)第三天），需氧菌菌總數(shù)培養(yǎng)結(jié)束，進行數(shù)據(jù)報告。耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門氏菌的接種平板觀察，耐膽鹽革蘭陰性菌的接種平板與培養(yǎng)管進行結(jié)果對應(yīng)，報告數(shù)據(jù)。大腸埃希菌、沙門氏菌接