中國藥典衛(wèi)生學檢驗培訓抑菌劑效力檢查法指導原則

1、抑菌劑效力檢查法指導原則,2010年版《中國藥典》一部附錄XVIII D2010年版《中國藥典》二部附錄XIX N,抑菌劑效力檢查法指導原則——目的,如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，在正常貯藏和使用過程中可能發(fā)生微生物污染和繁殖使藥物發(fā)生變質(zhì)而對使用者造成危害。故在生產(chǎn)過程中根據(jù)制劑特性添加適宜的抑菌劑以保證藥品的質(zhì)量。 所有抑菌劑都具有一定的毒性，其抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素而提高或降低，為保證

2、藥品的質(zhì)量和用藥安全，添加抑菌劑的量應根據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。 抑菌劑效力的測定可為生產(chǎn)過程中添加抑菌劑提供指導，隨著科學發(fā)展，新型抑菌劑大量出現(xiàn)，抑菌劑效力的測定更為重要；使生產(chǎn)者正確掌握產(chǎn)品中添加的抑菌劑的效力，有助于選擇合適的抑菌劑，也可對抑菌劑使用的正確性給予評價。,抑菌劑效力檢查法指導原則——國內(nèi)外現(xiàn)狀,目前歐洲、美國、英國等國藥典均已在附錄中收載了抑菌劑效力測定法，我國2010版藥典增訂抑菌劑效力

3、檢查法指導原則，目的在于縮短與歐美國家的距離，評價最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時也可用于指導生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑的確定。,抑菌效力檢查法指導原則——基本規(guī)定,抑菌劑效力檢查法系用于測定滅菌、非滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評價最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時也可用于指導生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑的確定。如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，那么應根據(jù)制劑特性（如水溶液制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏和使用過程中可能發(fā)生的微生物污染

4、和繁殖使藥物發(fā)生變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。在藥品生產(chǎn)過程中，抑菌劑不能用于替代藥品生產(chǎn)的GMP管理，不能作為非滅菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負載的手段。,,所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應為最低有效量。同時，為保證用藥安全，最終包裝容器中的抑菌劑有效濃度應低于對人體有害的濃度并在藥品包裝上注明添加抑菌劑的名稱和數(shù)量。 在制劑通則中要求具有抗菌活

5、性的制劑，不管是添加的抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，在藥物研發(fā)階段，均應確認其抗菌效力。抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低，因此，應驗證最終容器中的抑菌劑效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。 本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用于包裝未啟開的成品制劑。,抑菌效力檢查法指導原則——實驗要點,設計實驗方案；驗證計數(shù)測定方法；制備濃菌液（108cfu/ml）；原包裝接種；立即計數(shù)

6、與第7、14、28天計數(shù)；計數(shù)結(jié)果的常用對數(shù)值比較；結(jié)果判斷。,,抑菌劑效力測定實驗1.培養(yǎng)基：胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。注意：用于抑菌劑效力測定的培養(yǎng)基必須通過適用性檢查（包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基）。,,2.菌種：銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10 104]大腸埃希菌 [CMCC (B) 44 102]金黃色葡萄球

7、菌 [CMCC (B)26 003]白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]黑曲霉 [CMCC(F)98 003]試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代。制備成濃菌液（108cfu/ml）,菌液制備,接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中， 20～25℃培養(yǎng)24～48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液

8、制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中， 20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml 含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。 菌懸液制備后若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用，若保存在

9、2～8℃,可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。,,適用性檢查取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置20～25℃

10、培養(yǎng)72小時，計數(shù)；同時用對應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判斷該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。,,3.供試品接種：為了達到試驗目的，根據(jù)供試品的給藥途徑和用途將供試品分為四類，以便標準的制定和執(zhí)行。1類 注射劑、其他非腸道制劑，包括乳劑、 耳用制劑、無菌鼻用制劑及眼用制劑2

11、類 局部給藥制劑、非滅菌鼻用制劑及用于黏膜的乳劑3類 口服非固體制劑（非抗酸制劑）4類 非固體抗酸制劑,,抑菌劑效力可能受試驗用容器特征的影響，如容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此，只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同時容器便于按無菌操作接入試驗菌液、混合及取樣等，一般應將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進行貯存。每一容器接種一種試驗菌，接種量按供試品類別確定。若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉(zhuǎn)移

12、至無菌容器時，該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性（如吸附作用），特別應注意不得影響供試品的PH，PH對抑菌劑的活性影響很大，同時容器的口徑大小應便于供試品的進出及混勻。,,取包裝完整的供試品至少5份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至5個適宜的無菌容器中（若試驗菌株數(shù)超過5株，應增加相應的供試品份數(shù)），每一容器接種一個試驗菌。 1、2、3類供試品1g或1ml接種菌量為105～106cfu，4類供試品中1g或1ml接種菌量

13、為103～104cfu，接種菌液的體積不得超過供試品體積的0．5%～1% ，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布。,,4.貯存：接種的供試品在試驗期間置20~25℃避光貯存，控制溫度變化盡可能小，并防止被污染。 5.存活菌數(shù)測定：根據(jù)產(chǎn)品類型及表2規(guī)定的時間，分別從上述每一容器取供試品1ml（g）， 用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1：10； 1：100；1：1000等稀釋級，按驗證過的菌數(shù)測定方法（由于供試品中含有抑菌活性

14、，所以菌數(shù)測定方法應進行驗證）測定供試品中所含的菌數(shù)，并換算成lg值。,,6.結(jié)果判斷：計數(shù)結(jié)果與初始值（0時菌數(shù)）的常用對數(shù)值比較，根據(jù)表2進行判斷。試驗結(jié)果按有效數(shù)字的修約規(guī)則進舍，保留一位小數(shù)。結(jié)果符合表2要求可判斷該產(chǎn)品抑菌效力符合規(guī)定。,表2 抑菌劑抑菌效力判斷標準,1類供試品細菌：7天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天菌數(shù)下降不少于3.0lg，14天到28天菌數(shù)不增加真菌：與初始值比，7、14、28天菌數(shù)均不增加2類供試

15、品細菌：14天菌數(shù)下降不少于2.0lg，14天到28天菌數(shù)不增加真菌：與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增加3類供試品細菌：14天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天到28天菌數(shù)不增加真菌：與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增加4類供試品細菌、真菌：與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增加注：表中“不增加”是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5lg,,實例1、 氯化鈉注射液、 碳酸氫鈉注射液不含抑菌劑加入菌從初始到6h