中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內(nèi)毒素檢查方法學驗證內(nèi)容簡介

1、2006年8月,1,中國藥典2005年版無菌、微生物限度及細菌內(nèi)毒素檢查方法學驗證內(nèi)容簡介,2006.8,2006年8月,2,主要內(nèi)容,1、無菌檢查方法學驗證關鍵點及常見問題2、微生物限度檢查方法學驗證關鍵點及常見問題3、細菌內(nèi)毒素檢查方法學驗證關鍵點及常見問題,2006年8月,3,無菌檢查的方法學驗證,相關規(guī)定無菌檢查驗證的關鍵點驗證中常見的問題,2006年8月,4,一、相關規(guī)定 藥品無菌和微生物限度檢查方法驗證作為中國藥

2、典2005年版增訂的一項重要內(nèi)容對促進我國藥品微生物檢驗的標準化是十分重要和必要的，執(zhí)行近一年以來的情況表明，方法驗證是促使我國藥品無菌和微生物限度檢查方法更加合理、科學和嚴謹?shù)闹匾緩?。?006年6月全國會議紀要）,2006年8月,5,中檢所和藥典會多次召開會議肯定工作的成績、研討存在的問題，希望各級領導能給予高度重視，從各方面支持這項工作長期持續(xù)發(fā)展。 實際工作中，藥品生產(chǎn)、研發(fā)企業(yè)和各級藥檢所在工作中都存在很多困難和問題。,

3、2006年8月,6,關于執(zhí)行《中國藥典》2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關問題的說明國藥典發(fā)[2005]98號,各藥品檢驗所：    根據(jù)國食監(jiān)注[2005]234號“關于頒布和執(zhí)行《中國藥典》2005年版有關事宜的通知”規(guī)定，《中國藥典》7月1日起開始執(zhí)行，各藥品檢驗所在執(zhí)行“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”過程中遇到了一些問題，為保證《中國藥典》2005年版的順利實施，現(xiàn)就有關問題說明如

4、下：,2006年8月,7,1．“微生物限度檢查”和“無菌檢查”是藥品安全性檢查的重要項目。雖然近幾版《中國藥典》均收載有“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”，但在如何保證檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性方面與國外藥典相比仍具有一定差距，其關鍵是《中國藥典》未強調(diào)對檢驗方法進行必要的方法驗證。為此，藥典會設立專項科研課題，對2005年版《中國藥典》的“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”增加驗證試驗的必要性進行研討。根據(jù)研究結果，2005

5、年版《中國藥典》規(guī)定當進行藥品的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時應進行方法驗證。,2006年8月,8,,驗證的目的是為了確認試驗中供試品應選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、何種測定方法及確定的檢測系統(tǒng)是否適用于該供試品的檢驗，即只有通過方法驗證，才能確定供試品的檢驗條件和方法，保證“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法的科學性和檢驗結果的準確性。,2006年8月,9,2．不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，特別是中成藥，因原料來源、工藝、輔料的

6、不同，藥品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性；同一個企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，因原料來源不同、工藝改變或不同實驗室等原因，也可能導致檢測結果的差異。因此，不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種進行“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時，其具體試驗方法如沖洗量等不能簡單照搬，需通過驗證試驗核實該試驗方法和檢測系統(tǒng)是否適宜。,2006年8月,10,3．目前各藥檢所涉及的檢驗工作可分為三類：注冊檢驗（包括進口注冊和新藥注冊）、監(jiān)督抽驗和進口檢驗。考慮到各檢驗性質的差異，各口岸所

7、在進行進口復核及進口檢驗時，應請企業(yè)提供方法驗證材料或詳細的SOP資料進行審核；各口岸所完成復核時應在修訂的進口注冊標準中明確“微生物限度檢查”或“無菌檢查”的關鍵操作點（如供試品的處理方法等）及試驗方法（如平皿法、薄膜過濾法、直接接種法等），并在復核說明中概述驗證實驗結果，以方便以后的進口檢驗。,2006年8月,11,,對國內(nèi)新藥的注冊檢驗，也應請企業(yè)提供方法驗證資料，如果企業(yè)提供不出方法學驗證資料，根據(jù)藥品注冊管理辦法，應在審核意見

8、中明確指出“方法學未經(jīng)驗證，無法檢驗”，并建議企業(yè)重新建立“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法。監(jiān)督抽驗藥品，由于2005年版以前歷版《中國藥典》未強調(diào)進行方法學驗證，故各藥檢所目前在進行具體品種檢驗時難度較大，故也應請企業(yè)提供方法驗證資料并進行審核，未經(jīng)過方法學驗證的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”結果，決不能給出“符合2005年版《中國藥典》的規(guī)定”的結論。,2006年8月,12,國家藥典委員會    

9、;                              中國藥品生物制品檢定所     &#

10、160;                            二00五年十月十一日,2006年8月,13,● 驗證的目的: 驗證所采用的方法和條件是否適合于供試品的無菌

11、檢查。 即確認供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計。 ● 驗證的意義：保證檢驗結果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。,,2006年8月,14,二、無菌檢查驗證的關鍵點驗證的類型●前驗證: 建立藥品的微生物限度檢查法和無菌檢查法時（當建立藥品的無菌或微生物限度檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查）?！裨衮炞C: 修訂的檢驗方法;供試品的組分或原檢驗條件發(fā)生

12、改變可能影響檢驗結果時 ;定期的方法驗證（若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證） 。,2006年8月,15,無菌檢查驗證用菌株：,金黃色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **擬修訂為大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) [CMCC

13、(B) 63 501]生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003],2006年8月,16,菌株選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標準菌株(或該藥品中常見的污染菌)。菌名 分類

14、 芽孢 對氧需求銅綠假單胞菌 革蘭氏陰性桿菌 無芽孢 需氧枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽性桿菌 有芽孢 需氧金黃色葡萄球菌 革蘭氏陽性球菌 無芽孢 需氧大腸埃希菌 革蘭氏陰性短桿菌 無芽孢 需氧生孢梭菌 梭菌 有芽孢 厭氧,2006年8月,17,

15、菌種的要求： 傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。加菌量:＜100cfu。 驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每—試驗菌應逐一進行驗證。,2006年8月,18,菌液制備,接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培

16、養(yǎng)18-24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時，上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。,2006年8月,19,,接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無

17、菌試管內(nèi)，用0.9％無菌氧化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。,2006年8月,20,,驗證方法： 直接接種法 薄膜過濾法,2006年8月,21,薄膜過濾法,將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度

18、培養(yǎng)3～5天。各試驗菌同法操作。,2006年8月,22,直接接種法,取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人規(guī)定量的供試品，另1管作為對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天。,2006年8月,23,結果判斷：,與對照管比較，如含

19、供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。 如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用。,2006年8月,24,消除供試品抑菌的方法,增加沖洗量增加培養(yǎng)基的用量使用中和劑或滅活劑： β-內(nèi)酰胺酶、對氨基苯甲酸 更換濾膜品種注意：重新進行方法驗證。,2006年8月

20、,25,方法學驗證資料試驗記錄要點,總的要求：詳細、嚴謹、可操作性供試品信息檢驗數(shù)量和檢驗量：按照無菌檢查的量確定供試品處理、供試品溶液的制備檢驗方法（選擇直接接種法說明理由）實驗用菌 代數(shù)、稀釋級、計數(shù)檢驗條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時說明濾膜材質、儀器、泵速等條件）。需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明逐日記錄各菌的生長情況,2006年8月,26,方法學驗證資料試驗結論,采用的方法：薄膜過濾法

21、/直接接種法關鍵實驗點：如沖洗條件、中和、酶處理等因素,2006年8月,27,三、驗證及資料中常見的問題薄膜過濾法加菌的時機不一致（供試品中和陽性對照中）,按規(guī)定應在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，而驗證試驗主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質對陽性菌的生長的影響，可以與對照濾器比較而作出判斷，所以驗證試驗中加菌時機要與對照一致（中檢所講義）。,2006年8月,28,薄膜過濾法濾膜材質選擇不正確，直接影響試驗結果,普通濾膜有機膜低吸附濾

22、膜1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。2.應保證濾膜在過濾前后的完整性。3.采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。,2006年8月,29,驗證試驗：按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天 無菌檢查：陽性對照培養(yǎng)48～72h應生長良好,驗證試驗與無菌檢查培養(yǎng)觀察時間是不同的，不加區(qū)分影響對陽性菌生長緩慢的判斷,2006年8月,30,,敏感菌株與陽性對照菌不一致，降低了陽性對照菌的

23、意義 陽性對照菌不是驗證試驗選定的敏感菌株實際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽性對照只能選擇金黃色葡萄球菌。,2006年8月,31,關于大腸埃希菌的問題,供試品無菌檢查中規(guī)定“抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌”，但在方法學驗證中所用菌株沒有大腸埃希菌。解決措施：抗革蘭陰性菌的抗菌藥物進行方法學驗證時增加大腸埃希菌。即將修訂，將銅綠假單胞菌修訂為大腸埃希菌。修訂后按新方法執(zhí)行。,2006年8月,32

24、,薄膜過濾法和直接接種法如：一般供試品（無特殊說明），完全可以采用薄膜過濾法，而生產(chǎn)單位進行的無菌檢查驗證法為直接接種法。也有的廠家把兩種方法的驗證都寫上，結論中也沒有說明采用那種方法。CP2005：無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。修訂：改為薄膜過濾法重新進行驗證。,方法選擇錯誤，不符合CP2005版要求,2006年8月,33,進行供試品無菌檢查時，所采用的檢驗方法和檢驗條件應與驗證的

25、方法相同。結合無菌檢查檢驗數(shù)量和檢驗量確定驗證時取樣量。如同時進行無菌檢查一定要按照規(guī)定的檢驗數(shù)量和檢驗量取樣。,檢驗數(shù)量和檢驗量與驗證試驗的量不同，與CP2005版驗證要求不符,2006年8月,34,生產(chǎn)單位進行方法學驗證時檢驗數(shù)量要按照表1 批出廠產(chǎn)品最少檢驗數(shù)量。檢驗量（每只樣品接入每種培養(yǎng)基的最少樣品量）同上市抽驗品種。無菌檢查法中規(guī)定：只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。因此，驗證試驗中檢驗量就多不就少，

26、如10ml注射液，雖然每個濾膜每容器取2ml也符合藥典規(guī)定，10支分配至3個或更多濾筒也可，但建議取15支分3個濾筒（貴重藥品和抗生素品種可靈活掌握，但不能低于最少量）。,2006年8月,35,舉例說明上市抽驗樣品無菌檢查方法學驗證檢驗量（液體制劑）≤1ml 每個菌10支,共60支（全取樣）1＜V＜5 共30（取樣量為半量）5≤V＜20 建議30（取樣量為2ml，建議全部過濾）20≤V＜50 建議30（取樣

27、量為5ml，建議全部過濾）50≤V＜100 建議30（取樣量為10ml，建議全部過濾)50≤V＜100（靜脈給藥） 共30（取樣量為半量）100≤V≤500 共18（取樣量為半量）＞500,2006年8月,36,對檢驗數(shù)量和檢驗量的把握應考慮便于實際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器，檢驗數(shù)量大于藥典規(guī)定的6個，但檢驗量似乎不符合藥典規(guī)定的每袋樣品取半量檢驗的規(guī)定，僅為1/3，但根據(jù)藥典檢驗量即

28、為一次試驗所用供試品總量（g或ml）的解釋，這與先將6袋分配兩個濾筒，再將剩下3袋抽入一個濾筒作為樣定對照的方法一樣，卻更節(jié)省時間。（中檢所講義）,2006年8月,37,沖洗條件、沖洗量的選擇太盲目,有些廠家提供的驗證資料中，對非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml/次*10次/膜，增加了出現(xiàn)誤差的機會。1. 對膜的損傷2. 檢驗方法繁瑣，大大增加檢驗人員的工作量（檢驗要按照已經(jīng)驗證的方法進行）3. 驗證試驗方法選擇總的原則是

29、由易到難,2006年8月,38,沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。對于抑菌性較強的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過濾，以減少膜的吸附, 減少沖洗量。如：抗生素品種取規(guī)定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無菌容器中，然后再過濾。對于抑菌性較強的注射用無菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻?？咕幙梢愿鶕?jù)其抗菌譜選擇敏感菌先進行預試驗，找到合適的條件再進行其他菌的實驗。采用開放

30、式薄膜過濾器：濾膜分成幾份與取樣量、沖洗條件的選擇有關，建議盡量與無菌檢查法一致（最常見為3等分）。,2006年8月,39,方法描述不夠詳細，沒有可操作性,如某產(chǎn)品驗證資料“將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至……中，或將培養(yǎng)基加至濾筒中”。驗證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查”，方法確立后，以后該產(chǎn)品就可以采用該方法進行檢驗。應記錄取樣量

31、、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。,2006年8月,40,特殊情況,眼用液體制劑：制劑通則中規(guī)定，眼用液體制劑微生物限度檢查法為“除另有規(guī)定外，按薄膜過濾法或直接接種法檢查，至少從2支供試品抽取規(guī)定量（每種培養(yǎng)基各接種2支，每支1ml），直接或處理后接種于硫乙醇流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7天，不得有菌生長。若有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，各管均不得有菌生長?！毖塾靡后w制劑微生物限度檢查的方法驗證同無

32、菌檢查方法學驗證。,2006年8月,41,微生物限度檢查的方法學驗證,概述微生物檢查驗證的關鍵點驗證中常見的問題,2006年8月,42,一、概述,微生物限度檢查法驗證的目的：確認所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。驗證的內(nèi)容：包括準確性(回收率)、專屬性。驗證的類型：前驗證(建立微生物限度檢查法時的驗證)和再驗證(修訂檢驗方法后、供試品組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時、定期的方法驗證)。,2006年8月,43

33、,,根據(jù)檢查方法的不同分為： 細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證和控制菌檢查法的驗證。驗證的意義：保證檢驗結果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。,2006年8月,44,總體思路與程序,某些供試品含有抗微生物物質，使供試品中的活微生物的生長被抑制，不能按常規(guī)方法檢驗，必須以適當?shù)姆椒ㄏ蛞种乒┰嚻分锌刮⑸镂镔|的活性后，活微生物才能生長，得以檢出。通過消除或抑制供試品中抗微生物物質的活性來檢測微生物的方法，應通過驗證，以確定所用檢測

34、方法測定結果的可信度。,2006年8月,45,需要驗證的環(huán)節(jié),驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)均應有合理的證明（驗證），保證其對結果判斷沒有影響。前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應在驗證的范圍內(nèi)。已有標準規(guī)程（SOP）和充足實驗證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問應進一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當前驗證工作的重點,2006年8月,46,供試品中抗菌活性的去除,稀釋法——降低供試品的相對濃

35、度薄膜法——利用體積差異分離中和法——利用化學（生物）專屬性滅活離心法——利用沉降系數(shù)差異分離 各方法組合運用，會達到更好效果！,2006年8月,47,二、驗證的關鍵點,樣品：首先應是合格的樣品。本底微生物太多可以先滅活，但不應因此影響藥效。注意 針對抽驗品種本底微生物太高情況，如我們沒條件進行滅活處理，可對檢品適當稀釋后再進行驗證。（經(jīng)請示專業(yè)委員會認可）,2006年8月,48,檢驗量,指供試品一次檢驗的用量。一般為10

36、g 或 10ml; 化學藥膜劑為100cm2。貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗量改為10g或10ml。驗證實驗按檢驗量執(zhí)行。,2006年8月,49,樣品前處理,制劑形式多樣，決定前處理各異 液體供試品固體、半固體或粘稠液體供試品非水溶性供試品其他,2006年8月,50,液體供試品,取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無

37、菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。,2006年8月,51,固體、半固體或粘稠液體供試品,取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它有效方法混勻，作為供試液。(常規(guī)方法）必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴適當加溫使供試品分散均勻。,2006年8月,52,非水溶性供試品,方法一 2000版

38、已有方法 （乳化法）方法二2005版新增方法 （萃取法）,2006年8月,53,,軟膏、乳膏劑 先將已備妥滅菌的含司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的混合物融化，待冷至45℃時，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。,2006年8月,54,,油劑 取供試品10ml，加入無菌

39、聚山梨酯80 5~8ml，搖勻，再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。 栓劑 稱取供試品10g，加適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯80 5~8ml，振搖使之乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻。,2006年8月,55,,眼膏劑 取供試品10g，加至20ml無菌十四烷酸異丙酯，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶

40、解。然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5~10min，靜置，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。,2006年8月,56,,非水溶性膜劑 化學藥膜劑一般取樣量為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于45℃水浴保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（通常1 cm2加1ml或2ml），浸泡，振

41、搖，以供試品浸液作為供試液。,2006年8月,57,腸溶及結腸溶制劑供試品,取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。,2006年8月,58,氣霧劑、噴霧劑供試品,取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h，取出，速消毒供試品容器的開啟部位周圍，用無菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無

42、菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。,2006年8月,59,茶劑,取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。,2006年8月,60,注意：,以上供試品如吸水膨脹，或黏度過高，

43、可增加稀釋級的量，制成1：20～1：100供試液制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應驗證，在該檢驗條件無抗菌作用。目標是使不便于取樣的供試品分散均勻！,2006年8月,61,計數(shù)方法驗證定量——回收率測定實驗,在建立供試品的細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法或原法的檢驗條件有改變可能影響檢驗結果的準確性，應對檢查法的可靠性進行驗證。驗證時做規(guī)定菌的回收試驗，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實驗方法。,2006年8月,62,驗證用

44、菌株,細菌計數(shù)方法驗證用菌株： 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證 白色念珠菌、黑曲霉取培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含 50～100cfu/ml的菌液。,2006年8月,63,要求,驗證實驗應獨立平行進行3次，分別計算各次試驗菌的回收率。,2006年8月,64,具體方法,1)試驗組2)菌液組3)稀釋劑對照組4)供試品對照組,2006年8月,65,1.試驗組,平皿法計數(shù)時，取試驗可能

45、用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，應在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。,2006年8月,66,2.菌液組,測定所加的試驗菌數(shù),2006年8月,67,3.稀釋劑對照組,若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊

46、處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。,2006年8月,68,4.供試品對照組,取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。,2006年8月,69,回收率的計算,試驗組的菌回收率 稀釋劑對照組的菌回收率,,2006年8月,70,結果判斷指標,

47、在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應均不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，按此該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。,2006年8月,71,常規(guī)法,供試液的常規(guī)制備方法： 10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

48、至100ml, 制成1：10供試液,2006年8月,72,常規(guī)菌落計數(shù)方法的驗證過程,試驗組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50～100cfu試驗菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。,2006年8月,73,,菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。供試品對照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備

49、2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。,2006年8月,74,結果判斷,計算試驗組的菌回收率，若三次平行試驗各個試驗菌的回收率均不低于70%，按常規(guī)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。,2006年8月,75,培養(yǎng)基稀釋法,取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不

50、具抑菌作用。1ml供試液可等量分注多個平皿。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強的制劑。,2006年8月,76,,在采用培養(yǎng)基稀釋法時，應注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸實驗組（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應加1ml菌液。,2006年8月,77,以1ml供試液平均分注5個平皿的方法為例說明培養(yǎng)基稀釋法方法驗證的過程,10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml, 制成1：10供試液供試液制備方法為

51、常規(guī)法，無需進行稀釋劑對照組的實驗,2006年8月,78,試驗組：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml 菌液。計算每皿平均菌數(shù)（A）供試品組（本底組）：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。計算每皿平均菌數(shù)（B）菌液組：每皿加入1ml菌液，平行2皿。計算每皿平均菌數(shù)（C）回收率：（A-B）/C*100％,2006年8月,79,結果判斷：,計算試驗組的菌回收率，若三次平行試

52、驗各個試驗菌的回收率均不低于70%，按培養(yǎng)基稀釋法測定供試品的細菌數(shù)（或霉菌及酵母菌數(shù)）。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用其他方法，如薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。,2006年8月,80,離心沉淀集菌法,1：10供試液的制備：10g樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，低速離心（500rpm離5分鐘）去渣，取上清10ml高速離心（3000rpm離20分鐘）

53、，離心后不要震搖離心管（一般用10 ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8 ml棄去，再加 8  ml稀釋液補充到10 ml，混勻。,2006年8月,81,,試驗組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50～100cfu試驗菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平

54、行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。供試品對照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。,2006年8月,82,稀釋劑對照組：,取含菌稀釋液（含菌濃度為50～100cfu /ml）代替供試品，經(jīng)過低速離心后轉移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層8ml液體，再加 8  ml稀釋液補充到10 ml，混勻。取此液體1ml注入平皿中

55、，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 要保證稀釋劑對照組的操作過程與實驗組完全相同！,2006年8月,83,不建議使用離心沉淀集菌法,操作過程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。某些沉降系數(shù)低的細菌可能被漏檢，而驗證試驗無法對其驗證。對某些抑菌性不強的樣品建議采用培養(yǎng)基稀釋法。,2006年8月,84,薄膜過濾法,供試品對照組：取規(guī)定量供試品，相當于供試品1g或1ml，如1：10供試液取10

56、ml, 過濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對應培養(yǎng)基上，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。試驗組：過濾量，沖洗量同供試品對照組，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。,2006年8月,85,,菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。稀釋劑對照組：稀釋液+1ml菌液混勻，過濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗組） ，取出濾膜，按薄膜過

57、濾法測定其菌數(shù)。,2006年8月,86,注意：,如回收率仍達不到70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說的每次沖洗100ml?？蓪⒋^濾的樣品稀釋至大量稀釋液中（如: 500ml, 多少量需在驗證資料中注明）再進行過濾，這樣可以減少膜對樣品抑菌成分的吸附。沖洗速度不易過快，沖洗量不易過大?？膳c離心沉淀集菌法，中和法等方法聯(lián)用。,2006年8月,87,其他消除抑菌效果的方法,β-內(nèi)酰胺類抗生素 β-內(nèi)酰胺酶

58、奎諾酮類抗生素 0.1mol/L MnSO4,2006年8月,88,,當最低稀釋級的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗菌的回收率還無法達到計數(shù)方法驗證的要求時，根據(jù)供試品的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，可采用高一稀釋級的供試液重新進行回收率的測定。若試驗菌的回收率符合計數(shù)方法驗證的要求，那么，進行供試品細菌計數(shù)或霉菌及酵母菌計數(shù)時，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液 （中

59、國藥典2006 增補本擬增訂內(nèi)容）,2006年8月,89,控制菌檢查方法驗證定性——能否生長、專屬性實驗,樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗證一般口服制劑驗證大腸埃希菌外用制劑驗證金葡和銅綠含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗證,2006年8月,90,試驗菌株,按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌梭菌檢查用生孢梭菌。菌種的要求：不得超過5代。菌液制備為10～100cfu

60、/ml。,2006年8月,91,1.試驗組,取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。,2006年8月,92,2.陰性菌對照組,設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗組。陰性對照菌不得檢出。,2006年8月,93,,2006年8月,94,結果

61、判斷,陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。試驗組未檢出試驗菌，應采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。驗證試驗可與供試品的控制菌檢查同時進行,2006年8月,95,總結一般的驗證過程：,第一步：常規(guī)法第二步：培養(yǎng)基稀釋法第三步：薄膜過濾法在計數(shù)方法驗證時先用常規(guī)法對5種實驗菌進行預實驗，如果某

62、個或某些菌的回收率達不到70%，繼續(xù)用它驗證下一步的實驗方法。直到它的回收率達到70%以上。這時再用5種菌進行平行試驗。,,,,,,2006年8月,96,關于驗證菌中敏感菌的選擇,相關文件選擇原則,2006年8月,97,第七屆全國藥品檢驗所抗生素室主任工作會議暨全國藥品微生物檢驗方法及標準研討會會議紀要（微生物檢驗部分）,為了進一步理順方法驗證和目前監(jiān)督抽驗工作的關系，討論認為應對以建立科學合理的檢驗方法為目的的方法驗證試驗和對監(jiān)督抽

63、驗工作中所采用抽驗方法的有效性的確認實驗加以區(qū)分，具體有如下三點：,2006年8月,98,1. 對于注冊檢驗，如果沒有合理的檢驗方法，應嚴格按照藥典要求，通過完整的驗證試驗建立標準檢驗方法及SOP，所建立的標準檢驗方法中應確定具體的實驗方法，如無菌檢查中的薄膜過濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過濾法。標準檢驗方法中應有關鍵的實驗要點，如無菌檢查薄膜過濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（0.5ml/皿、0

64、.2ml/皿應注明）。對有抗菌作用的樣品應通過驗證試驗確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗方法時進行方法的確認使用。,2006年8月,99,2. 對注冊檢驗中已有驗證資料的方法進行復核時，應根據(jù)企業(yè)提供材料的情況，結合藥檢所掌握的情況，通過分析判斷、適當?shù)膶嶒烌炞C等，保證驗證資料中檢驗方法的合理、可靠和科學。,2006年8月,100,,3. 對于目前比較突出的已上市品種的監(jiān)督抽驗問題，原則上應向被抽驗品種的生產(chǎn)單位索取方法驗證資料，如資料中

65、已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認或調(diào)整檢驗方法。如果沒有及時獲得驗證資料，或者驗證資料中沒有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進行方法確認試驗，其他品種可從藥典驗證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗方法，一般細菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認實驗可和檢驗同步進行。,2006年8月,101,敏感菌株的選擇原則,首先是個動態(tài)的選擇；目前針對固定品

66、種尚未有固定或法定的方法；敏感菌株可以是一株菌，也可是兩株或更多；敏感菌株不一定是藥典規(guī)定的驗證用菌株；由于新藥生產(chǎn)過程中的諸多不穩(wěn)定因素，對于注冊品種建議按照藥典規(guī)定菌株逐一進行驗證。,2006年8月,102,針對抽驗品種,如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認或調(diào)整檢驗方法；可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進行方法確認試驗；其他品種可從藥典驗證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗方法；一般細菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃

67、色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌；其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認實驗可和檢驗同步進行。,2006年8月,103,,抗厭氧菌的，應選擇生孢梭菌；抗革蘭氏陰性菌的，應選擇大腸桿菌；對無明顯抗菌活性的中藥品種（包括注射劑），我們在實驗中發(fā)現(xiàn)多對枯草芽孢桿菌較為敏感，而對霉菌不敏感；建議中藥品種（包括注射劑），細菌首選擇枯草芽孢桿菌，真菌選擇白色念珠菌。,2006年8月,104,2005版《中國藥典》細菌內(nèi)毒素檢驗及方法建立,山東省藥

68、品檢驗所2006.８ 濟南,2006年8月,105,內(nèi)容,細菌內(nèi)毒素概述細菌內(nèi)毒素檢查方法建立的指導原則細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立與驗證細菌內(nèi)毒素檢查附：中外藥典細菌內(nèi)毒素檢查方法收載 及修訂情況,2006年8月,106,細菌內(nèi)毒素概述 前言 細菌內(nèi)毒素,,2006年8月,107,一、前言,自20世紀60年代鱟血凝集機制的發(fā)現(xiàn)和鱟實驗方法的建立以來，引起了各國藥政管理部門的極大興趣，

69、并使細菌內(nèi)毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應用和發(fā)展。尤其是與家兔熱原法相比，細菌內(nèi)毒素檢查法具有勞動強度低，實驗成本小等特點，還可以通過對原料、活性成分、滅菌水、容器、賦形劑和終產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素檢測，對生產(chǎn)過程進行質控，更明顯的特點是可以定量檢測藥品生產(chǎn)過程中可能污染的痕量內(nèi)毒素，并且為區(qū)分干擾作用與內(nèi)毒素污染提供了極為重要的技術手段。,2006年8月,108,二、細菌內(nèi)毒素,1 細菌內(nèi)毒素與熱原的關系 注射給藥過