中國藥典年版儀器分析增修訂概況

1、現(xiàn)代分析技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)大,《中國藥典》2010年版一部新修訂項(xiàng)目,2010年版二部與2005年版藥典主要項(xiàng)目收載情況比對(duì)表,柱色譜紙色譜薄層色譜氣相色譜,色譜法在2010年版藥典的應(yīng)用,高效液相色譜 離子色譜凝膠色譜毛細(xì)管電泳,正相色譜 反相色譜離子對(duì)色譜,,色譜法的應(yīng)用：紙色譜,紙色譜的基本原理-分配色譜固定相-吸附在濾紙上的水移動(dòng)相-展開劑樣品在水和展開劑中的溶解度不同，故分配不同而達(dá)到分離。例：鹽酸苯乙

2、雙胍,色譜法的應(yīng)用：薄層色譜,2010版藥典（二部）采用TLC的品種數(shù)量，共435個(gè),色譜法的應(yīng)用：氣相色譜,,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,20世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10 µm 的無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC 被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 ～ 10 µm 球形硅膠。90年代早期，粒徑為 5 µm 的高純硅膠，即所謂的 B

3、 型硅膠被發(fā)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種 B 型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了 3 µm 或 3.5 µm 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。手性色譜柱的開發(fā)。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于 2 µm 的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場(chǎng)上流行的分析用的 HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要為 B 型硅膠。,

4、填料發(fā)展史,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,,填料發(fā)展史,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,技術(shù)A：低金屬不純物的含量,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,技術(shù)B：不同的配體密度,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,Inersil（ ODS-2，5μm，4.6mm×250mm）柱色譜圖 （阿奇霉素）,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,迪馬公司（鉆石，5μm，4.6mm×250mm）柱色譜圖,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,Waters(XBridgeT

5、MShield RP18 5μm，4.6mm×250mm)柱色譜圖,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,資生堂MGⅡ5μm，4.6mm×150mm色譜柱圖譜,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,2010版藥典二部中色譜柱的使用情況,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,離子對(duì)色譜法是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的

6、離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對(duì)色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,

7、2010版藥典主要修訂項(xiàng)目1、色譜柱 （1）常用色譜柱填料粒徑3～10μm （2）微徑柱填料粒徑 約2μm（UPLC或UFLC） 硬件須匹配 色譜條件可適當(dāng)調(diào)整 以品種正文規(guī)定條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn) 2、柱溫 （1）通常為室溫 （2）以硅膠為載體的普通色譜柱，最高使用溫度不得

8、超過 60℃，（HTLC）,色譜法的應(yīng)用：高效液相色譜,3、有些色譜條件可適當(dāng)調(diào)整，但流動(dòng)相比例的調(diào)整有明確 規(guī)定。組分比例較低者（＜50%）相對(duì)于自身的改變量 不超過±30%，相當(dāng)于總量的改變量不超過±10%。如 ±30%的相對(duì)改變量超過總量的10%時(shí)，則以后者為準(zhǔn)。4、系統(tǒng)適用性試驗(yàn) （1）理論板數(shù)n

9、 或 （2）分離度R（關(guān)鍵指標(biāo)） 或5、拖尾因子 必要時(shí)，應(yīng)規(guī)定拖尾因子,基本原理離子色譜中發(fā)生的基本過程就是離子交換，因此，離子色譜本質(zhì)上就是離子交換色譜。在離子色譜的基本組成中，重要的和與其他高效液相色譜不同的就是抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器，離子色譜用的泵是PEEK材料襯里的不銹鋼泵。,色譜法的應(yīng)用：離子色譜,離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及

10、核酸等離子型化合物的分離。,固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季銨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。,色譜法的應(yīng)用：離子色譜,色譜法的應(yīng)用：離子色譜,陽離子交換柱山梨醇及制劑甘油果糖氯化鈉注射液甘露醇及制劑

11、利巴韋林及制劑鹽酸二甲雙胍及制劑蘋果酸及制劑富馬酸及制劑,陰離子交換柱肝素鈉及制劑帕米磷酸二鈉及制劑氯膦酸二鈉及制劑硫酸軟骨素鈉及制劑,例：離子色譜（氯膦酸二鈉）,照離子色譜法（附錄Ⅴ J）試驗(yàn)用陰離子交換色譜柱（推薦使用IonPac AS11-HC，或效能相當(dāng)），柱溫30℃，以水為流動(dòng)相A，以0.1mol/L氫氧化鉀溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速為1.2 ml/min。檢測(cè)器為電導(dǎo)檢測(cè)器，檢測(cè)方式為抑制電導(dǎo)檢測(cè)。

12、,用于氯膦酸二鈉原料藥的有關(guān)物質(zhì)與制劑的含量測(cè)定,固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如多糖、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。,色譜法的應(yīng)用：凝膠色譜法,色譜法的應(yīng)用：凝膠色譜法,固定相→多孔性凝膠流動(dòng)相→水——凝膠過濾色譜(GFC)流動(dòng)相→

13、有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜(GPC) 滲透系數(shù)（Kp）僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動(dòng)相的性質(zhì)無關(guān)。,分離機(jī)制： 利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離 排阻色譜可以將尺寸不同的高分子按照保留時(shí)間分開。保留時(shí)間越小的高分子（也就是流經(jīng)色譜柱需要時(shí)間越短的高分子）的分子量越大，相反，保留時(shí)間越大的高分子（也就是流經(jīng)色譜柱需要時(shí)間越長(zhǎng)的高分子）的分子量越小。,,,2010版藥典二部采用常壓凝

14、膠色譜的品種,2010版藥典二部采用高效凝膠色譜的品種,2010版藥典二部采用高效凝膠色譜的品種,,2010版藥典二部采用電泳法的品種,色譜法的應(yīng)用：電泳及毛細(xì)管電泳法,2010版藥典二部采用CE的品種,例：毛細(xì)管電泳（抑肽酶）,SDS-PAGE凝膠電泳圖,例：毛細(xì)管電泳（抑肽酶）,生物分析（芯片）儀對(duì)抑肽酶分子量和純度的測(cè)定結(jié)果,蘭州大得利生物化學(xué)制藥（廠）有限公司提供的抑肽酶的分子量和其它兩個(gè)廠家的分子量有明顯差異。抑肽酶的純度測(cè)

15、定結(jié)果7批供試品都接近100%，可能是抑肽酶和有關(guān)物質(zhì)的分子量相差不大，生物分析（芯片）儀采用的是SDS-PAGE電泳分離的原理，不能將其分離，不能作為分析抑肽酶純度的方法。,例：毛細(xì)管電泳（抑肽酶）,sigma抑肽酶對(duì)照品毛細(xì)管電泳譜圖,例：毛細(xì)管電泳（抑肽酶）,供試品毛細(xì)管電泳譜圖（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：071015）,例：毛細(xì)管電泳（抑肽酶）,色譜法的應(yīng)用：毛細(xì)管電泳,分離模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE膠束電動(dòng)毛細(xì)管色

16、譜MEKC毛細(xì)管等電聚焦CIEF毛細(xì)管凝膠電泳CGE毛細(xì)管電色譜CEC,高分子化合物的分析手性化合物的分析,,,,色譜法的應(yīng)用：液相色譜常用檢測(cè)器,光學(xué)檢測(cè)器：紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射（通用型檢測(cè)器）電化學(xué)檢測(cè)器：極譜、庫侖、安培電學(xué)檢測(cè)器：電導(dǎo)、介電常數(shù)質(zhì)譜檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器：靈敏度較高,2010版藥典二部采用檢測(cè)器情況,色譜法的應(yīng)用：液相色譜常用檢測(cè)器,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,優(yōu)點(diǎn)：適用于沒有特征紫

17、外吸收或紫外吸收很弱的待測(cè)物，使用UV時(shí)靈敏度更低；無需衍生化而直接測(cè)定，避免了衍生帶來的誤差?？梢詰?yīng)用有強(qiáng)紫外吸收的試劑，如氯仿、丙酮等。適用于組分復(fù)雜樣品的分析，可以進(jìn)行梯度洗脫，基線平穩(wěn)。通用型檢測(cè)器，只要待測(cè)物揮發(fā)性低于溶劑，即可適用。對(duì)不同物質(zhì)，ELSD相應(yīng)因子的變化比其它檢測(cè)器要小得多。對(duì)環(huán)境影響不靈敏，室溫下即可操作。沒有溶劑前緣峰，適用于保留時(shí)間短的物質(zhì)的檢測(cè)。與LC-MS的色譜條件一致，可直接進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換。

18、,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,影響ELSD響應(yīng)的因素載氣流速、霧化器設(shè)計(jì)與溫度、流動(dòng)相的組成和流速等影響霧化過程。被分析物的濃度和體積質(zhì)量決定了進(jìn)入光散射池的氣溶膠中的顆粒的直徑。被分析物的折射指數(shù)、光源發(fā)出的光的強(qiáng)度和波長(zhǎng)、光電倍增管的位置等影響散射光強(qiáng)度。光電倍增管的靈敏度和入射光的強(qiáng)度決定了檢測(cè)的效率，反映為實(shí)驗(yàn)者所觀測(cè)的峰面積。,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,圖 硫酸核糖霉素有關(guān)物質(zhì)

19、色譜圖（蒸發(fā)管溫度：65℃，分流模式）,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,圖 硫酸核糖霉素有關(guān)物質(zhì)色譜圖（蒸發(fā)管溫度：110℃，不分流模式）,色譜法的應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,謹(jǐn)慎使用，充分優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。企業(yè)質(zhì)控人員和藥檢所人員均需要。漂移管溫度的優(yōu)化：溫度對(duì)響應(yīng)值的影響無明顯的規(guī)律性。最優(yōu)溫度為在流動(dòng)相基本揮發(fā)的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度。霧化氣流速的優(yōu)化：流速越大，響應(yīng)值越低。最優(yōu)氣體流速應(yīng)是在可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大

20、檢測(cè)響應(yīng)值的最低氣體流速。,,色譜法的應(yīng)用：示差折光檢測(cè)器,原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率來測(cè)定試樣中各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器缺點(diǎn)： 1）對(duì)溫度變化敏感 2）對(duì)溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測(cè) 3）屬于中等靈敏度的檢測(cè)器,色譜法的應(yīng)用：示差折光檢測(cè)器,山梨醇山梨醇注射液甘露醇甘露醇注射液乳果糖口服溶液,葡甲胺麥芽糖乳糖倍他環(huán)糊精羥丙基倍

21、他環(huán)糊精,色譜法的應(yīng)用：電導(dǎo)檢測(cè)器,原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來測(cè)定電離物質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)流動(dòng)相流速和壓力的改變不敏感，可用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：對(duì)溫度變化敏感（每升高1度，電導(dǎo)率增加2%-2.5%)。廣泛應(yīng)用于離子色譜。主要用于檢測(cè)水溶性無機(jī)和有機(jī)離子。,色譜法的應(yīng)用：電導(dǎo)檢測(cè)器,,帕米膦酸二鈉注射液注射用帕米膦酸二鈉鹽酸頭孢吡肟注射用鹽酸頭孢吡肟,氯膦酸二鈉氯膦酸二鈉注射液氯膦酸二鈉膠囊,色譜法的應(yīng)

22、用：質(zhì)譜檢測(cè)器,色譜法的應(yīng)用：質(zhì)譜檢測(cè)器,離子化方式：電噴霧大氣壓化學(xué)電離MALDI,質(zhì)量分析器：四級(jí)桿離子肼飛行時(shí)間磁分析器傅立葉變換離子回旋共振,方法學(xué)驗(yàn)證的重要工具,,紅外光譜,紅外光譜集，將出第四卷，譜號(hào)是唯一性的，如第四卷重新收錄了上卷已收錄品種的圖譜，則上卷圖譜作廢。紅外光譜廣泛應(yīng)用于原料藥的鑒別中，2010年版藥典增加了紅外光譜在制劑鑒別中的應(yīng)用。如樣品制備方法能夠較好地排除輔料的干擾，

23、則采用全譜比較法；如不能，則采用了特征波數(shù)法。對(duì)于具有同質(zhì)異晶現(xiàn)象的藥品，應(yīng)選用有效晶型的圖譜，或分別與同晶型對(duì)照品/光譜比較；晶型不一致，需要轉(zhuǎn)晶的，應(yīng)規(guī)定轉(zhuǎn)晶條件，給出處理方法和重結(jié)晶所用溶劑。,紅外光譜主要修訂項(xiàng)目,1、原料藥鑒別 遇多晶干擾 （1）按規(guī)定對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理（重結(jié)晶與干燥） （2）采用對(duì)照品平行操作 （3）采用溶液法 2、制劑鑒別

24、（1）提?。ㄈ軇┑倪x擇） 輔料無干擾，晶型不變 直接與標(biāo)準(zhǔn)光譜比對(duì) 輔料無干擾，晶型有變 與對(duì)照品同法處理后比對(duì) 輔料有干擾，晶型不變 在指紋區(qū)選擇3～5個(gè)特征譜帶 波數(shù)允差為0.5% 輔料有干擾，晶型有變 不宜采用紅外鑒別3、多組

25、份原料藥的鑒別 可借鑒制劑鑒別的方法4、混晶中無效或低效晶型的限度控制 采用基線密度計(jì)算指定譜帶的吸光度后，再計(jì)算各晶型的相對(duì)含量（甲苯咪唑和棕櫚氯霉素）,附一農(nóng)藥殘留量測(cè)定法,中藥中農(nóng)藥殘留量的狀況 中藥材及飲片22個(gè)品種,共165批樣品1、方法學(xué) 由單一GC法擴(kuò)大為GC、HPLC、GC/MS和LC/MS2、農(nóng)藥品種 由24種（其中有機(jī)氯9、擬除蟲菊酯3和有機(jī)磷12）擴(kuò)充為色譜法124種（其中有機(jī)氯和擬除蟲

26、菊57、有機(jī)磷54和氨基甲酸酯13），按色-質(zhì)聯(lián)用法統(tǒng)計(jì)則為128種。3、測(cè)定方法分兩個(gè)層次： 一為色譜法（GC、HPLC） 方法包括樣品前處理（提取、凈化）、色譜測(cè)定、色譜驗(yàn)證和 質(zhì)譜確證 二為色-質(zhì)聯(lián)機(jī)法（GC/MS、LC/MS） 方法包括樣品前處理（提取、凈化）、色-質(zhì)聯(lián)機(jī)測(cè)定,農(nóng)藥分析質(zhì)譜圖及色譜圖,53

27、種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品GC/MS總離子流圖,74種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品LC/MS/MS總離子流圖,15種有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)照品溶液色譜圖-ECD,19種有機(jī)磷類農(nóng)藥對(duì)照品溶液色譜圖－FPD,附二中藥指紋圖譜,色譜指紋圖譜確實(shí)能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體變化情況和質(zhì)量的均一程度本質(zhì)上是藥典色譜技術(shù)在應(yīng)用上的延伸控制產(chǎn)品批與批間的穩(wěn)定切實(shí)可行。2005版收載高效液相色譜特征圖譜1項(xiàng)2010版收載高效液相色譜特征圖譜11項(xiàng)，指紋圖譜11項(xiàng)使整體性

28、控制中藥質(zhì)量的方法學(xué)和實(shí)際應(yīng)用方面有了大幅度的提高，確保中藥質(zhì)量的均一穩(wěn)定,中藥指紋圖譜,中成藥收載指紋圖譜6項(xiàng)，特征圖譜2項(xiàng)。 采用指紋圖譜檢測(cè)的品種 桂枝茯苓膠囊 天舒膠囊 復(fù)方丹參滴丸 注射用雙黃連 腰痛寧膠囊 諾迪康膠囊 采用特征圖譜檢測(cè)的品種 烏靈膠囊 百令膠囊,注射用雙黃連指紋圖譜,注射用雙黃連

29、藥材、提取物、成品的相關(guān)性,,HPLC 指紋圖譜HPLC 指紋圖譜上的10 個(gè)峰均得到了明確的指認(rèn)，指認(rèn)的峰面積之和已占總峰面積的89%。,腫節(jié)風(fēng),,烏靈膠囊樣品色譜圖,6、金雀異黃素　　　 S、5-甲基蜂蜜曲菌素,,本版藥典用于計(jì)算兩個(gè)圖譜相似程度的計(jì)算機(jī)軟件為國家藥典委員會(huì)發(fā)行的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》,例：中藥中問題的解決,1 手性流動(dòng)相添加劑解決了積雪草總苷等的同分異構(gòu)體色譜分離難題2 指紋圖譜的控制

30、保證了茵陳從基原、生產(chǎn)工藝,提取物及制劑的 質(zhì)量3 有關(guān)物質(zhì)的控制完善了薄荷腦的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),1 手性流動(dòng)相添加劑解決了積雪草總苷等的同分異構(gòu)體色譜分離難題,積雪草苷羥基積雪草苷多對(duì)烏蘇烷型和齊墩果烷型結(jié)構(gòu)異構(gòu)的同分異構(gòu)體,主要成分,原標(biāo)準(zhǔn)存在問題,含量測(cè)定方法為紫外分光光度法，專屬性較差HPLC采用常規(guī)流動(dòng)相，羥基積雪草苷難以與其同分異構(gòu)體分離,解決方案,加入手性流動(dòng)相添加劑β-環(huán)糊精，實(shí)現(xiàn)積雪草苷、羥基積雪草苷多成分同系統(tǒng)定量,

31、困擾已久的難題,,積雪草總苷標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜,羥基積雪草苷,積雪草苷,,,羥基積雪草苷（medecassoside）C48H78O20,積雪草苷B（asiaticoside B）C48H78O20,2 指紋圖譜的控制保證了茵陳從基原、生產(chǎn)工藝到提取物及制劑的質(zhì)量,“綿茵陳”及“茵陳蒿”性狀完全不同有效成分差異較大,藥材基原劃分,藥材質(zhì)量控制,以具利膽作用的綠原酸和對(duì)羥基苯乙酮為指標(biāo)建立綿茵陳的多成分含量測(cè)定藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)大幅提高,提取物