八年制綜合實(shí)驗(yàn)

1、HBV DNA定量檢測(cè),上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉湘帆 講師,PCR基因的原理,一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理 1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。 1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Kary Mullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。,PCR原理,PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下

2、延伸引物，重復(fù) “變性→退火→引物延伸”過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。,PCR的基本原理,,PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理,PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制,技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。,熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-time

3、quantitative PCR,RQ-PCR）,,熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又稱(chēng)實(shí)時(shí)PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法FQ-PCR通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量,,熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光譜分析的精確性，直接檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中雙鏈DNA熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。系統(tǒng)內(nèi)裝置有

4、半導(dǎo)體PCR、鹵鎢燈光源激發(fā)熒光信號(hào)、光柵分光、超低溫光電耦合器（CCD）攝象機(jī)收集熒光信號(hào)、計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)等。,,,,,,,,,熒光定量PCR檢測(cè)的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測(cè)定初始濃度需要在對(duì)數(shù)期進(jìn)行。,The software displays the fluorescence signals in real-time immediately after each measurement. Signals from the sa

5、mples are obtained as the machine positions the capillaries sequentially over the optical unit. During thermal cycling, fluorescence can be measured once per cycle for every capillary and the fluorescence values are disp

6、layed immediately on the screen and updated after every cycle (Fig.3). The generated data are stored for further analysis.,熒光定量PCR在每一次循環(huán)后對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，因此能最準(zhǔn)確反映出對(duì)數(shù)期。確定準(zhǔn)確的初始濃度。,軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)定、保存數(shù)據(jù)和報(bào)告結(jié)果，并將結(jié)果自動(dòng)保存在計(jì)算機(jī)中。,,,相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增

7、的擴(kuò)增曲線圖。,,,①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。,Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃

8、度，影響因素小，所以具有良好的重現(xiàn)性。　　研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。,,利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,,熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqMan probe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù)4、分子信標(biāo),T

9、he biggest disadvantage of SYBR is that it binds to any dsDNA; the specific product, non-specific products and primer dimers are detected equally well.  The LightCycler Instrument allows melting curve analysis Once

10、the melting point of the product has been determined the LightCycler Instrument's flexible programming allows the user to acquire fluorescence above the melting temperature of the primer dimers, but below the melting

11、 temperature of the product.,缺點(diǎn)：存在非特異性產(chǎn)物，可以與非特異性產(chǎn)物，甚至引物二聚體結(jié)合發(fā)出熒光。,可以使用熔點(diǎn)曲線分析進(jìn)行鑒別，明顯提高診斷的特異性。（F1通道）,2、TaqMan水解探針技術(shù),,雜交探針技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物定量又稱(chēng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET需要一對(duì)引物和一對(duì)探針，探針A的3`端為熒光染料供體；探針B的5`端作為熒光染料受體。2個(gè)探針首尾相連，僅差一個(gè)堿基。檢測(cè)在退火時(shí)進(jìn)行。,Advant

12、ages of the LightCycler SystemWatch amplification as it occurs: real-time, on-line fluorescence allows you to see the results of every cycle as soon as PCR proceeds Save time: extremely rapid PCR, 20 minutes for 30 cyc

13、les Verify amplicon specificity: melting curve analysis provides differentiation between amplification products Detect mutations: changes in the melting curve analysis can be used to identify mutations Minimize contam

14、ination: amplification and detection are performed in the same closed tube,熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1）定量準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)監(jiān)控2） 敏感性和特異性高3）簡(jiǎn)單快速，30個(gè)循環(huán)20幾分鐘就能夠完成。4）污染可能性小5）不需要常規(guī)的產(chǎn)物后期復(fù)雜處理，直接觀測(cè)結(jié)果6）可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析，根據(jù)熔點(diǎn)曲線的不同直接分析點(diǎn)突變的情況。,,Figure 3. Mutatio

15、n detection by melting curve analysis. Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique meltin

16、g peak of each genotype. The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks (red plot).,HBV的定量檢測(cè),標(biāo)本：病人血清200μl檢測(cè)：HBV病毒核酸載量檢測(cè)樣本：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照

17、 標(biāo)準(zhǔn)品、病人HBV DNA檢測(cè)步驟：HBV DNA提?。?熒光定量 PCR； 結(jié)果分析定量PCR方法：TaqMan水解探針技術(shù),標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,報(bào)告結(jié)果： HBV DNA拷貝數(shù)/ml， 如 6.20×106拷貝數(shù)/ml或6.20 E +06 參考范圍：最小檢測(cè)值，5×102拷貝數(shù)/ml（5E+02）