2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、第五章體內(nèi)藥物分析,體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品中藥物、代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)的定量分析。,其中血樣是體內(nèi)藥物分析的主要樣品體內(nèi)藥物分析是測(cè)定以上樣品中: 1. 原型藥物 2. 代謝產(chǎn)物 3. 內(nèi)源性活性物質(zhì) 4. 結(jié)合物(綴合物) 5. 結(jié)合藥物,體內(nèi)藥物分析,體內(nèi)樣品:生物體液、頭發(fā)、臟器和組織。,體內(nèi)藥物分析經(jīng)常用于: 1. 藥代動(dòng)力學(xué)研究(PK) C-

2、t曲線 2. 代謝組學(xué)研究 3. 臨床治療藥物檢測(cè)(TDM) 4. 新藥研究中藥理、藥效、毒性試驗(yàn)(臨床前試驗(yàn)研究),對(duì)體內(nèi)樣品(生物樣品)進(jìn)行檢驗(yàn),研究生物體內(nèi)藥物濃度、存在狀態(tài)、生物利用度.,涉及到藥物體內(nèi)作用機(jī)制探討、藥物質(zhì)量、安全性、有效性評(píng)價(jià)及臨床合理用藥。,體內(nèi)樣品性質(zhì)特點(diǎn): 1. 采樣量少 數(shù)ml ~數(shù)十 μl 2. 待測(cè)濃度低 10-9 ~ 10-6 g/ml,甚至10-12 g/ml

3、3. 干擾物之多 內(nèi)源性物質(zhì),體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn): 1. 樣品需經(jīng)分離和濃集或化學(xué)衍生化 2. 要求分析方法靈敏度高、專屬性強(qiáng) 3. 分析工作量大,結(jié)果數(shù)據(jù)處理繁雜,主要常用測(cè)定方法:色譜法、免疫學(xué)法、生物學(xué)法,如:GC、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、 LC-TOF-MS,建立可靠的和可重復(fù)的定量分析方法是進(jìn)行體內(nèi)樣品分析的基礎(chǔ),為保證方法的可行性、可靠性,建立的分析方法在用于實(shí)際樣品

4、分析前,必須進(jìn)行充分地方法學(xué)驗(yàn)證,生物樣本:生物體的任何臟器組織、體液均可作為生物樣本.常用樣本:血液(血漿、血清或全血)、尿液、唾液、毛發(fā),一.體內(nèi)樣品種類,,第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏,二、體內(nèi)樣品的采集和制備(一)血樣 適用-藥物藥動(dòng)學(xué)研究、生物利用度、治療藥物檢測(cè)等研究與實(shí)際工作。,血藥濃度通常指血漿、血清中的濃度。其中的血藥濃度能夠反映藥物在體內(nèi)(靶器官)的狀況。是體內(nèi)藥物分析最常用的樣本,1.血樣采集,動(dòng)物

5、(采血不得超過(guò)總量的1/10)人:靜脈采血1-5ml,2.血漿的制備:將采取的全血置含有抗凝劑(肝素)的試管中,混勻1000×g離心力5-10min,使血細(xì)胞分離,分取上清液為血漿,3.血清的制備:采血后在室溫下至少放置30min-1h,凝結(jié)出血餅,剝?nèi)パ灒?1000×g離心力離心5-10min,分取上清液為血清。,血漿和血清中藥物濃度值通常是相同的,血漿比血清分離快,且制取量多(全血的50%~60%),4.全血

6、的制備:加抗凝劑采血不離心,放置室溫后可分層,上層血漿下層血細(xì)胞。 測(cè)定血細(xì)胞內(nèi)、外藥物濃度,血漿藥物濃度波動(dòng)大、濃度低時(shí)應(yīng)考慮用全血。,貯藏,采血后及時(shí)分離。短期保存:4℃長(zhǎng)期保存: -20℃或-70~-80℃全血未經(jīng)分離不宜冷凍,適用-藥物劑量回收、腎清除率和生物利用度測(cè)定、藥代動(dòng)力學(xué)研究等.,體內(nèi)藥物的清除主要通過(guò)尿液的排出。藥物可以原型或代謝產(chǎn)物及綴合物等形式排出。,(二) 尿液,尿液中藥物濃度高,收集量大、方便。但

7、尿液濃度通常變化較大。,采樣后應(yīng)立即測(cè)定。否則應(yīng)加入防腐劑或冷藏,尿液中藥物濃度與血藥濃度相關(guān)性差;不宜采樣的人群:腎功能不良者、兒童,(三) 唾液,唾液pH值在6.2-7.4;含有粘蛋白約為血漿的1/10、電解質(zhì)含量同細(xì)胞外液,粘度是水的1.9倍。采樣后經(jīng)放置后除去泡沫后, 以3000r/min離心10min分離,分取上清液作為藥物濃度測(cè)定的樣品。,唾液作為樣品測(cè)定藥物濃度優(yōu)點(diǎn):采樣容易;有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物

8、濃度。但與血漿藥物濃度相比易變動(dòng);濃度低需高靈敏度監(jiān)測(cè)儀器。,一些藥物的唾液濃度S與血漿濃度P呈密切相關(guān),因此在TDM中測(cè)S替代 P。,(四) 組織常用的臟器組織:胃、肝、腎、心、腦等 1. 樣品的制備 先制成勻漿液━━萃取藥物 2.樣品處理 ①沉淀蛋白法 ②酸水解或堿水解法 ③酶水解法,,(五) 毛發(fā)(頭發(fā)),適用:微量元素測(cè)定方法:有機(jī)破壞法 濕法破壞 干法破壞

9、 氧瓶燃燒法,測(cè)定方法為原子吸收分光光度法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。,第二節(jié)、體內(nèi)樣品分析的前處理技術(shù),1. 使藥物游離,使蛋白結(jié)合型的藥物中釋出來(lái)測(cè)定,2. 滿足測(cè)定方法的要求 分離與濃集,3. 改善分析環(huán)境 保護(hù)儀器性能,如HPLC色譜柱,方法:(1)去蛋白質(zhì) (2)分離、純化、濃集  ?。?)綴合物水解 (4)化學(xué)衍生化,一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的,二、常用體內(nèi)樣品處理方法,一般在測(cè)定前

10、預(yù)處理:分離、濃集或改性,(一)蛋白質(zhì)的去除,① 溶劑沉淀法 加入與水混溶的有機(jī)溶劑(1:2~3) ——溶液D 、蛋白質(zhì)分子間靜電引力 而聚集;與蛋白質(zhì)氫鍵變化而凝聚;親水性溶劑的水和作用使蛋白質(zhì)脫水而析出,使藥物釋放。 常用溶劑乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等離心分離,高速離心機(jī)( ~15000×g ,5min) 上清液偏堿(pH8.5 ~ 9.5),,,② 中性鹽析法

11、 加入中性鹽(1:2混合)——“鹽析”沉淀蛋白質(zhì),使蛋白質(zhì)脫水而沉淀;離子強(qiáng)度發(fā)生變化使蛋白質(zhì)分子間電排斥作用減弱而凝集。 常用的中性鹽有:硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。 高速離心機(jī)離心約2min分離上清液近中性pH7.0 ~ 7.7,③ 加入強(qiáng)酸(1:0.6混合) ——與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀常用的強(qiáng)酸:10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等。(高速離心機(jī)離心約2min )上清液近呈酸

12、性pH 0 ~ 4。不適宜在酸性中分解的藥物。,④ 熱凝固法 要求藥物熱穩(wěn)定好,通常加熱至90℃ ,使熱變性蛋白沉淀,高速離心或過(guò)濾法除去。 方法最簡(jiǎn)單,只能除去熱變性蛋白。,(二)分離純化與濃集,①液相萃取法(LLE) 新方法新技術(shù): ②固相萃?。⊿PE)  ③超濾法,一般濃集方法:①使被測(cè)組分提取體積?、趽]去提取溶劑(使用尖錐形試管)殘?jiān)鼜?fù)溶于小體積 通入氮?dú)猓ǖ祪x)

13、;減壓揮干溶劑,,1.液-液萃取法(LLE),對(duì)有機(jī)溶劑的要求:①對(duì)藥物分子未電離的可溶、電離的不溶 ②沸點(diǎn)低易揮發(fā)③與水不相溶④無(wú)毒、不乳化。⑤較高穩(wěn)定性、惰性⑥不影響紫外檢測(cè) 常用:乙醚、三氯甲烷、異丙醇,多數(shù)藥物:弱極性、親脂性強(qiáng)。多為堿性內(nèi)源性雜質(zhì):強(qiáng)極性、水溶性強(qiáng)。酸性 根據(jù)溶劑、藥物、內(nèi)源性雜質(zhì)的極性、酸堿性,選擇合適

14、的溶劑分離雜質(zhì)、純化樣品。,注意的問(wèn)題,①pH值影響:多數(shù)藥物是親脂性的堿性物質(zhì)。內(nèi)源性雜質(zhì)多為酸性,故在堿性條件(pH高于pKa1~2 pH單位)下乙醚提取 ;酸性藥物則在酸性條件 (pH低于pKa1~2 pH單位)下提取,可使90%的藥物以非電離形式存在。但一般多在堿性條件下提取,減少內(nèi)源性物質(zhì)干擾。,②有機(jī)相與水相樣品溶劑比(1:1~2),③一般只提一次。若雜質(zhì)不易除去,可將有機(jī)相再用堿水(酸性藥物)或酸水(堿性藥物)反提。再用

15、有機(jī)溶劑提取。,對(duì)堿性中不穩(wěn)定的藥物或中性藥物,在中性pH處用三氯甲烷和異丙醇提取。,①選擇性和低廉的運(yùn)行成本(有機(jī)溶劑選擇性高,本法的選擇性亦高)②可對(duì)樣品凈化和濃集(能與多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)分離)③易乳化,LLE法的特點(diǎn):,2. 固相萃?。⊿PE)——規(guī)??s小的柱色譜,將具有吸附、分配、交換性質(zhì)的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱制成,體內(nèi)樣品處理。,微型柱的使用:溶劑淋洗 生物樣品上柱(藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時(shí)被保留到固定相上),

16、,,,洗脫雜質(zhì) 洗脫藥物,,(1)固相萃取法的原理,常用于SPE填充柱填料大致分為兩類:第一類為親脂型:大型吸附樹(shù)脂、親脂性鍵合硅膠,第二類為親水性型:硅膠、硅藻土、棉纖維。,,第三類為離子交換型,例如:Bond Elut微型柱——極性、非極性硅膠 Sep-pak系列微型柱——C18等填料,微型柱使用的一般步驟:步驟1:用有機(jī)溶劑如甲醇,預(yù)先濕潤(rùn)微型柱,使增加填料與待測(cè)物相互作用的表面積,并

17、可除去可能干擾分析的填料殘留物。步驟2:用色譜純的水或合適的溶劑沖洗,除去過(guò)多的甲醇,并為樣品提供表面積。步驟3:進(jìn)樣,通過(guò)微型柱廢液棄去。步驟4:用水或合適溶劑洗柱,選擇性地除去將會(huì)干擾后面色譜分析的內(nèi)源性雜質(zhì)步驟5:用合適的溶劑洗脫樣品,收集,洗脫液用于后面的分析測(cè)定或進(jìn)一步研究。,SPE優(yōu)點(diǎn): (與LLE相比)引入雜質(zhì)少;消除乳化現(xiàn)象;提取效率高;樣品用量小(50 ~ 100 μl);處理樣品快速;適宜處理?yè)]發(fā)性及不穩(wěn)定

18、性的藥品;溶劑安全。,3.超濾法 ——以多孔半透膜(超濾膜)為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。 血清中的游離藥物測(cè)定可采用分子量截留值在5萬(wàn)左右的超濾膜,以加壓過(guò)濾或高速離心法將游離藥物和血漿蛋白分離。 簡(jiǎn)便快捷,結(jié)果穩(wěn)定可靠,已成為首選方法。 優(yōu)點(diǎn):不引入化學(xué)試劑、無(wú)相態(tài)變化、對(duì)待測(cè)藥物破壞小。,,(三)綴合物的水解,尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài).

19、 含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物,可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸 葡萄糖醛酸甙綴合物。 含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸 綴 硫酸酯綴合物。 由于綴合物較原型藥物具有較大的極性,不易被有機(jī)溶劑提取。為測(cè)定尿液中藥物總量,需將綴合物中藥物釋出.,1. 酸水解 HCl 2. 酶水解 葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶 3. 溶劑解法,,,① 使藥物變成具有被分離的性

20、質(zhì)?、凇√岣邫z測(cè)靈敏度?、邸≡鰪?qiáng)藥物的穩(wěn)定性 ④ 提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離能力,,(四)化學(xué)衍生化,含有活潑H如: —COOH、 —OH、 — NH2、—NH—、—SH等官能團(tuán),化學(xué)衍生化對(duì)GC和HPLC尤為重要。,1.GC中化學(xué)衍生化法  衍生化可使藥物分子中的極性基團(tuán),如羥基、氨基、羧基等變成無(wú)極性的、易于揮發(fā)的藥物,從而使GC的溫度不必很高即可適合GC的分析要求。 主要的衍生化反應(yīng)有硅烷化、?;?、烷基化、不對(duì)稱衍

21、生化等。其中以硅烷化用得最廣泛。,具有光學(xué)異構(gòu)體的藥物。具有不同的藥效和藥動(dòng)學(xué)特性,因此,異構(gòu)體的分離也是十分重要的。采用不對(duì)稱試劑,使其生成非對(duì)映異構(gòu)體衍生物,然后用GC法或HPLC法進(jìn)行分析測(cè)定。,當(dāng)采用HPLC法時(shí),其衍生化的目的是為了提高藥物的檢測(cè)靈敏度。一些在紫外、可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有吸收或者摩爾吸收系數(shù)小的藥物,可以使其與衍生成對(duì)可見(jiàn)-紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器及電化學(xué)檢測(cè)器等具有高靈敏度的衍生物。,按衍生化反應(yīng)的方式可分為:

22、 色譜柱柱前衍生和柱后衍生兩種,2.HPLC中化學(xué)衍生化法,柱后衍生化: 藥物經(jīng)色譜柱分離之后進(jìn)行的,可形成對(duì)檢測(cè)器具有高靈敏度的衍生物,從而提高了選擇性。HPLC常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹酰氯、熒胺等。,柱前衍生化: 分離前使藥物與衍生化試劑反應(yīng),故與藥物具有相同官能團(tuán)的雜質(zhì)也會(huì)同樣生成衍生,這樣就有可能妨礙藥物的檢測(cè)。同時(shí),如果雜質(zhì)含量多時(shí),藥物與衍生化試劑的反應(yīng)率降低,因此應(yīng)盡可能將藥物進(jìn)行精制后再衍生化

23、,柱后衍生的例子: 氨基酸分析儀,氨基酸分別從色譜柱分離流出后,與顯色劑茚三酮相遇,在一定條件下,發(fā)生顯色反應(yīng),生成有色的衍生物,在440nm和570nm處被檢測(cè)。,衍生化方法:1.紫外衍生化 在紫外無(wú)吸收或吸收系數(shù)很小的化合物與具有紫外吸收基團(tuán)的衍生化試劑反應(yīng)2.熒光衍生化 在紫外無(wú)吸收或檢測(cè)不靈敏的藥物與熒光試劑反應(yīng)成強(qiáng)熒光衍生物3.手性衍生化 用手性衍生化試劑將藥物手性異構(gòu)體變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)體,用常規(guī)HPL

24、C分離分析,,第三節(jié)、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證,一、分析方法的建立(一)分析方法的選擇1.色譜分析法 LC-TOF-MS2.免疫分析法3.生物學(xué)方法(二)分析方法建立的一般程序1.色譜條件的篩選2.色譜條件的優(yōu)化3.實(shí)際樣品的測(cè)試,,1.色譜條件的篩選①取樣:待測(cè)藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)法)等的對(duì)照品②測(cè)定:按擬定方法(不包括體內(nèi)樣品預(yù)處理)測(cè)定③調(diào)整色譜條件:色譜柱、流動(dòng)相、溫度、進(jìn)樣量、濃度④滿足:良好的

25、色譜參數(shù)(n、R、T);適當(dāng)?shù)腞t以避開(kāi)干擾:選擇檢測(cè)器的靈敏度以獲得方法的靈敏度(LOQ),,2.色譜條件的優(yōu)化(1)試劑與溶劑試驗(yàn):取待測(cè)藥物的非生物介質(zhì)溶液,按擬定的方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)、萃取分離等預(yù)處理。通過(guò)改變條件(衍生化、萃取條件、溶劑極性和配比等) 考察反應(yīng)試劑對(duì)測(cè)定的干擾(無(wú)衍生化、萃取則不作該考察)(2)生物介質(zhì)試驗(yàn):取空白生物介質(zhì)按預(yù)處理方法操作??疾焐锝橘|(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。在“信號(hào)窗”內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性

26、物質(zhì)信號(hào)。,,(3)質(zhì)控樣品試驗(yàn)(quality control,QC試驗(yàn)) 取空白生物介質(zhì),按實(shí)際體內(nèi)預(yù)期濃度范圍,加入待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)物制成標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控(QC)樣品,照生物介質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下方法試驗(yàn)。 完成以下各項(xiàng)驗(yàn)證及評(píng)價(jià): ①建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;②定量范圍;③準(zhǔn)確度;④精密度;⑤靈敏度;⑥提取回收率;⑦樣品穩(wěn)定性 色譜峰的n、R、T是否與水溶液一致;色譜峰是否為單一成分;標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點(diǎn)等,以說(shuō)明內(nèi)源性

27、物質(zhì)是否干擾。,3.實(shí)際樣品的測(cè)試:方法建立后,需對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)試,考察實(shí)際干擾情況,進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性。,,二、分析方法的驗(yàn)證(一)特異性(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍(三)定量下線( LLOQ )(四)準(zhǔn)確度與精密度(五)樣品穩(wěn)定性(六)提取回收率 ……(十一)名詞解釋,,(六)提取回收率 指從生物介質(zhì)中回收得到待測(cè)物響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)值的比值(%)。 ———用來(lái)評(píng)價(jià)樣品處理方法將體內(nèi)樣品

28、中待測(cè)物從生物介質(zhì)中提取出來(lái)的能力。,,取空白生物介質(zhì)加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,制備高、中、低三個(gè)濃度(各5份)的QC樣品,依擬定的方法操作測(cè)定,測(cè)得Ar 。,測(cè)定法:,另取空白生物介質(zhì),照QC樣品同法處理后,加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,同法制備高、中、低三個(gè)濃度(各5份)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品,同法測(cè)定,測(cè)得As 。,提取回收率應(yīng)一致,結(jié)果的精密可重現(xiàn),而非待測(cè)物提取的是否完全。中、高濃度RSD應(yīng)不大于15%;低濃度RSD應(yīng)不大于20%。,,(十一)名詞解釋1

29、.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):用于制備標(biāo)準(zhǔn)樣品、QC樣品的待測(cè)物的參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。來(lái)源:①法定標(biāo)準(zhǔn)物②市購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)物③自制具有一定純度的標(biāo)準(zhǔn)物。2.生物介質(zhì):一種生物來(lái)源的物質(zhì),能以可重復(fù)的方式采集處理4.標(biāo)準(zhǔn)樣品:空白生物介質(zhì)加入已知量待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成樣品,用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算QC樣品和未知樣品中待測(cè)物濃度。5.質(zhì)控樣品(QC樣品):空白生物介質(zhì)加入已知量待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成樣品,用于監(jiān)測(cè)生物樣品分析方法的效能和評(píng)價(jià)每一分析批中未知樣品分析結(jié)果的完整

30、性和正確性。7.未知溶液(研究樣品):作為分析對(duì)象的體內(nèi)樣品8.制備溶液:待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)各步驟處理制成的直接用于儀器分析的試樣。9.分析批:未知樣品、適當(dāng)數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)樣品、 QC樣品的完整系列,結(jié)合生物樣品性質(zhì),闡述體內(nèi)樣品分析的特點(diǎn)。 如何制備血清、血漿?在測(cè)定血樣時(shí),為何首先應(yīng)去除蛋白質(zhì),去除蛋白有哪幾種方法?生物樣品前處理的方法有哪些?色譜法分析生物樣品時(shí),常用的化學(xué)衍生化方法有哪些?簡(jiǎn)

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