質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

1、1,質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,2,色譜：混合物分離質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：GC-MS；LC-MS；,色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀,基本工作原理是：利用一種具有分離技術(shù)的儀器，作為質(zhì)譜儀的"進(jìn)樣器"，將有機(jī)混合物分離成純組分進(jìn)入質(zhì)譜儀，充分發(fā)揮質(zhì)譜儀的分析特長(zhǎng)，為每個(gè)組分提供分子量和分子結(jié)構(gòu)信息。,3,GC-MS,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器（ 簡(jiǎn)稱氣質(zhì)聯(lián)用，GC-MS）是分析儀器中較早實(shí)現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)的儀器。,4,一

2、、GC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，主要是圍繞以下三個(gè)問(wèn)題的解決而不斷取得進(jìn)展的：1.氣相色譜柱出口氣體壓力和質(zhì)譜正常工作所需要的高真空的適配；2.質(zhì)譜掃描速度和色譜峰流出時(shí)間的相互適應(yīng)；3.必須能同時(shí)檢驗(yàn)色譜和質(zhì)譜信號(hào)，獲得完整的色譜、質(zhì)譜圖。,5,要使氣相色譜和質(zhì)譜儀器聯(lián)用，首先要解決的問(wèn)題是氣壓?jiǎn)栴}。色譜柱出口壓通常是常壓，而質(zhì)譜儀在正常工作壓力是高真空，故二者無(wú)法相接。必須采用一個(gè)連接器，用來(lái)除去載氣，以降低氣相色譜流出物的氣壓并

3、富集試樣，以達(dá)到質(zhì)譜儀的工作要求。,6,GC-MS聯(lián)用儀的接口是解決氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的關(guān)鍵組件。接口作用：（1）   壓力匹配——質(zhì)譜離子源的真空度在10-4Pa，而GC色譜柱出口壓力高達(dá)105Pa，接口的作用就是要使兩者壓力匹配。（2）  組分濃縮——從GC色譜柱流出的氣體中有大量載氣，接口的作用是排除載氣，使被測(cè)物濃縮后進(jìn)入離子源。,7,常見(jiàn)接口技術(shù)有：a    

4、 直接連接法（主要用于毛細(xì)管柱）在色譜柱和離子源之間用長(zhǎng)約50cm，內(nèi)徑0.5mm的不銹鋼毛細(xì)管連接，色譜流出物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管全部進(jìn)入離子源，這種接口技術(shù)樣品利用率高。b     開(kāi)口分流連接 該接口是放空一部分色譜流出物，讓另一部分進(jìn)入質(zhì)譜儀，通過(guò)不斷流入清洗氦氣，將多余流出物帶走。此法樣品利用率低。,8,9,2、掃描速度沒(méi)與色譜儀聯(lián)接的質(zhì)譜計(jì)一般對(duì)掃描速度要求不高。和氣相色譜儀聯(lián)

5、接的質(zhì)譜計(jì)，由于氣相色譜峰很窄，有的僅幾秒鐘時(shí)間。一個(gè)完整的色譜峰通常需要至少 6個(gè)以上數(shù)據(jù)點(diǎn)。這樣就要求質(zhì)譜儀有較高的掃描速度，才能在很短的時(shí)間內(nèi)完成多次全范圍的質(zhì)量掃描。另一方面，要求質(zhì)譜計(jì)能很快地在不同的質(zhì)量數(shù)之間來(lái)回切換，以滿足選擇離子檢測(cè)的需要。,10,,3、GC-MS檢測(cè)器必須能同時(shí)檢驗(yàn)色譜和質(zhì)譜信號(hào)，獲得完整的色譜、質(zhì)譜圖。,11,,二、GC-MS的掃描方式：質(zhì)譜儀掃描方式有兩種：全掃描和選擇離子掃描。,12,全掃描是對(duì)指

6、定質(zhì)量范圍內(nèi)的離子全部掃描并記錄，得到的是正常的質(zhì)譜圖，這種質(zhì)譜圖可以提供未知物的分子量和結(jié)構(gòu)信息?？梢赃M(jìn)行庫(kù)檢索（定性）。在全掃描模式中，質(zhì)譜圖是在色譜運(yùn)行期間連續(xù)獲得的。通常，以掃描模式操作的GC-MS可產(chǎn)生三維數(shù)據(jù)陣列，記錄的強(qiáng)度既是時(shí)間（含有色譜信息）又是質(zhì)量（質(zhì)譜信息）的函數(shù)。具有不同信息含量的不同類型數(shù)據(jù)就可從這個(gè)三 維數(shù)據(jù)陣列中獲取。,13,,另外一種掃描方式叫選擇離子監(jiān)測(cè)(select ion Monirin

7、g SIM)。這種掃描方式只對(duì)選定的離子進(jìn)行檢測(cè)，而其它離子不被記錄。它的最大優(yōu)點(diǎn)一是對(duì)離子進(jìn)行選擇性檢測(cè)，只記錄特征的、感興趣的離子，不相關(guān)的，干擾離子統(tǒng)統(tǒng)被排除，二是選定離子的檢測(cè)靈敏度大大提高。,14,,由于選擇離子掃描只能檢測(cè)有限的幾個(gè)離子，不能得到完整的質(zhì)譜圖，因此不能用來(lái)進(jìn)行未知物定性分析。但是如果選定的離子有很好的特征性，也可以用來(lái)表示某種化合物的存在。選擇離子掃描方式最主要的用途是定量分析，由于它的選擇性好，可以把由全掃

8、描方式得到的非常復(fù)雜的總離子色譜圖變得十分簡(jiǎn)單，消除其它組分造成的干擾。,15,三、GC-MS分析得到的主要信息：樣品的總離子色譜圖；樣品中每一個(gè)組分的質(zhì)譜圖；每個(gè)質(zhì)譜圖的檢索結(jié)果。此外，還可以得到質(zhì)量色譜圖、三維色譜質(zhì)譜圖等。對(duì)于高分辨率質(zhì)譜計(jì)，還可以得到化合物的精確分子量和分子式。,16,總離子色譜圖的橫坐標(biāo)是出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)是峰高。圖中每個(gè)峰表示樣品的一個(gè)組份，由每個(gè)峰可以得到相應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖。峰面積和該組份含量成正

9、比，可用于定量。,總離子色譜圖 （TIC）,17,質(zhì)譜圖： 由總離子色譜圖可以得到任何一個(gè)組分的質(zhì)譜圖。得到質(zhì)譜圖后可以通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索對(duì)未知化合物進(jìn)行定性。檢索結(jié)果可以給出幾個(gè)可能的化合物。并以匹配度大小順序排列出這些化合物的名稱、分子式、分子量和結(jié)構(gòu)式等。使用者可以根據(jù)檢索結(jié)果和其它的信息，對(duì)未知物進(jìn)行定性分析。應(yīng)用最為廣泛的有NIST庫(kù)和Wiley庫(kù)，前者目前有標(biāo)準(zhǔn)化合物譜圖13萬(wàn)張，后者有近30萬(wàn)張。此外還有毒品庫(kù)，農(nóng)藥庫(kù)等專用譜

10、庫(kù)。,18,總離子色譜圖是將每個(gè)質(zhì)譜的所有離子加合得到的。同樣，由質(zhì)譜中任何一個(gè)質(zhì)量的離子也可以得到色譜圖，即質(zhì)量色譜圖。質(zhì)量色譜圖是由全掃描質(zhì)譜中提取一種質(zhì)量的離子得到的色譜圖，因此，又稱為提取離子色譜圖。,利用這一特點(diǎn)可以識(shí)別具有某種特征的化合物，也可以通過(guò)選擇不同質(zhì)量的離子做質(zhì)量色譜圖，使正常色譜不能分開(kāi)的兩個(gè)峰實(shí)現(xiàn)分離，以便進(jìn)行定量分析。,20,GC-MS操作條件的優(yōu)化,在GC-MS分析中，色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集時(shí)同時(shí)進(jìn)行的

11、。為了使每個(gè)組分都得到有效的分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。,21,色譜分析條件：,色譜柱類型：填充柱或毛細(xì)管柱,22,22,固定液的選擇總原則：“ 相似相溶 ”(1) 分離非極性組分時(shí) 通常選用非極性固定相。各組分按沸點(diǎn)順序出峰,低沸點(diǎn)組分先出峰。(2) 分離極性組分時(shí) 一般選用極性固定液。各組分按極性大小順序流出色譜柱，極性小的先出峰。,固定液種類,23,23,(3) 分離非極性和極性的混合物

12、 一般選用極性固定液。此時(shí)，非極性組分先出峰，極性的（或易被極化的）組分后出峰。,(4) 分離醇、胺、水等強(qiáng)極性和能形成氫鍵的化合物 通常選擇極性或氫鍵性的固定液。(5) 組成復(fù)雜、較難分離的試樣 通常使用特殊固定液，或混合固定相。,載氣流量,由圖可見(jiàn)存在最佳流速（uopt）。,25,,氣化溫度分流比等,26,質(zhì)譜條件：,電離電壓電子電流掃描速率質(zhì)量范圍,27,GC-MS與GC相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）其定性

13、參數(shù)增加，定性可靠；（2）它是一種高靈敏度的通用型檢測(cè)器；（3）可同時(shí)對(duì)多種化合物進(jìn)行測(cè)量而不受基質(zhì)干擾；（4）定量精度較高。,28,在GC-MS分析中，常用的離子源有EI，CI，EI±CI復(fù)合源，場(chǎng)致電離源（FI），大氣壓化學(xué)電離源（APCI）等。,29,30,GC-MS的應(yīng)用,氣/質(zhì)聯(lián)用是解決復(fù)雜樣品全組分定性定量分析的有力工具。在分析檢測(cè)和研究的領(lǐng)域中起著越來(lái)越重要的作用，特別是在有機(jī)化合物常規(guī)檢測(cè)工作中幾乎成為一

14、種必備的手段。,31,,氣質(zhì)聯(lián)用儀應(yīng)用范圍： 1、凡是需要?dú)庀嗌V儀進(jìn)行檢測(cè)的場(chǎng)合，特別是對(duì)未知樣品進(jìn)行定性分析的地方 2、應(yīng)對(duì)各種突發(fā)事件，如有害物質(zhì)泄漏、重大環(huán)境災(zāi)害等 3、反恐斗爭(zhēng)、禁毒緝毒、爆炸物品分析等,32,,石化、化工、食品、環(huán)保、藥物研究、生產(chǎn)、質(zhì)控以及進(jìn)出口許多領(lǐng)域的眾多環(huán)節(jié)中都要用到GC/MS；法庭醫(yī)學(xué)中各類案件的現(xiàn)場(chǎng)采集物分析（嘔吐液、血液等）、毒藥、毒品檢驗(yàn)與鑒定；甚至體育競(jìng)技

15、運(yùn)動(dòng)中，國(guó)際公認(rèn)用GC/MS對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行興奮劑檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠。,33,,世界反興奮劑組織（WADA）提出六大類禁用的藥物：興奮藥物，麻醉劑，合成代謝/類固醇，利尿劑，肽類激素和相關(guān)的化合物，以及其它的禁用藥物。這些類別包括400種化合物和上千種相關(guān)的化合物。,34,,興奮劑類藥物目的：在比賽中，可以提高機(jī)敏和沖擊能力而減輕疲勞。用途：長(zhǎng)跑，單車，美式足球，棒球分析儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀化合物舉例：安非他明，咖啡因，可卡因和麻黃堿,35,

16、,麻醉藥目的：在訓(xùn)練和比賽中減少痛感。用途：拳擊，接觸性運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目，及其它訓(xùn)練中快速恢復(fù)的項(xiàng)目分析儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀化合物舉例：海洛因，嗎啡，美沙酮和鴉片,36,合成代謝/類固醇 目的：在訓(xùn)練中增加肌肉的強(qiáng)度和塊頭用途：所有的項(xiàng)目，包括舉重，體操，田徑分析儀器：氣相，液相，質(zhì)譜化合物舉例：睪丸激素，19-去甲睪酮，THG,β-激動(dòng)劑 利尿劑     &

17、#160;           目的：降體重，通過(guò)排小便逃避興奮劑檢查用途：與體重有關(guān)的項(xiàng)目，如舉重，摔跤和拳擊；也可能用于所有運(yùn)動(dòng)用于逃避興奮劑檢查分析儀器：氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜化合物舉例：甘露醇，Dexa-trim,37,肽類激素和有關(guān)的化合物目的：增加肌肉強(qiáng)度和塊頭，增加承受力用途：各種運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目；例如，生長(zhǎng)

18、激素和因子被用于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和強(qiáng)壯身體，促紅細(xì)胞增長(zhǎng)素（EPO）用于增加耐力，如自行車和長(zhǎng)跑項(xiàng)目分析儀器：液相色譜，質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫；藥物濫用準(zhǔn)確確認(rèn)比較困難，因?yàn)槿梭w自然就有此類化合物化合物舉例：人生長(zhǎng)激素（HGH）和促紅細(xì)跑生長(zhǎng)素（EPO） 其它禁用藥物      目的：許多藥物，盡管還沒(méi)有被認(rèn)為可以加強(qiáng)體能用途：多種運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目；例如，β-阻斷劑被用于需要高

19、注意力的項(xiàng)目（射擊，射箭項(xiàng)目），可以平靜心情和減少收顫。分析儀器：氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜化合物舉例：皮質(zhì)激素，β-阻斷劑， 酒精，局部麻醉藥，大麻,38,,樣品分析流程和檢測(cè)手段大多數(shù)藥物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的三種主要技術(shù)是，氣相色譜，液相色譜和質(zhì)譜。這些具有極高的靈敏度的檢測(cè)技術(shù)確保每一個(gè)藥物使用者都無(wú)法逃脫。例如，它們能夠檢測(cè)出比賽前十個(gè)月服用的合成類固醇激素藥物。,39,,安捷倫科技大量的儀器設(shè)備被用于2004年雅典奧運(yùn)會(huì)的藥品檢測(cè)

20、；不僅大量使用三種傳統(tǒng)儀器設(shè)備---氣相色譜(GC),液相色譜（HPLC）和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）, 當(dāng)時(shí)最新的液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS）也成為興奮劑檢測(cè)的有利武器.,40,,安捷倫科技在2008年北京奧運(yùn)會(huì)的藥品檢測(cè)工作中的作用會(huì)與以往歷屆奧運(yùn)會(huì)相同，為中國(guó)反興奮劑中心提供最先進(jìn)的儀器設(shè)備,優(yōu)質(zhì)的售后服務(wù)和技術(shù)支持.,41,在藥物的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和研究中有廣泛的應(yīng)用，特別在中藥揮發(fā)性成分的鑒定、食品和中藥中農(nóng)藥殘留

21、量的測(cè)定。,42,醫(yī)藥十幾種先天性代謝疾病，也叫先天性代謝缺陷（Inborn error of metabolism ，IEM）現(xiàn)在都可以通過(guò)新生兒篩檢試驗(yàn)測(cè)到，特別是使用氣相色譜－質(zhì)譜法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。GC-MS可以測(cè)定尿中的化合物，甚至該化合物在非常小的濃度下都可被測(cè)出。這些化合物在正常人體內(nèi)不存在，但出現(xiàn)在患代謝疾病的人群中。因而，該方法日益成為早期診斷IEM的常用方法，這樣及早指定治療方案最終導(dǎo)致更好的預(yù)后。目前能用GC-MS在出生時(shí)

22、，通過(guò)尿液監(jiān)測(cè)測(cè)出100種以上遺傳性代謝異常。,43,食品、飲料和香水分析食品和飲料中包含大量芳香化合物。一些是天然就存在于原材料中另外一些是在加工時(shí)形成的。GC-MS廣泛地用于分析這些化合物，它們包括：酯、脂肪酸、醇、醛、萜類等。GC-MS也用于測(cè)定由于腐壞和摻假所造成的污染物，這些污染物可能是有害的，而且，常常由政府有關(guān)部門對(duì)其實(shí)行控制。例如，殺蟲(chóng)劑。,44,,社會(huì)安全9．11后開(kāi)發(fā)的爆炸物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)成為全美國(guó)飛機(jī)場(chǎng)設(shè)施的一部分。

23、這些監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的操作依賴大量的技術(shù)，其中，許多是基于GC-MS的。,45,What is it?,46,在食品制作需要檢查蛋白質(zhì)含量，但是直接測(cè)量蛋白質(zhì)含量技術(shù)上比較復(fù)雜，成本也比較高，不適合大范圍推廣，所以業(yè)界常常使用一種叫做“凱氏定氮法”的方法，通過(guò)食品中氮原子的含量來(lái)間接推算蛋白質(zhì)的含量。也就是說(shuō)，食品中氮原子含量越高，這蛋白質(zhì)含量就越高。因此，三聚氰胺被派上大用場(chǎng)了。,47,,蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過(guò)30%，而三

24、聚氰胺的分子式含氮量為66％左右。通用的蛋白質(zhì)測(cè)試方法“凱氏定氮法”是通過(guò)測(cè)出含氮量來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會(huì)使得食品的蛋白質(zhì)測(cè)試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過(guò)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的測(cè)試。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測(cè)試蛋白質(zhì)含量增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒(méi)有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。,48,,2008年9月，中國(guó)爆發(fā)三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導(dǎo)致食用了受污染奶粉

25、的嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥，其原因是奶粉中含有三聚氰胺。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加劑，禁止人為添加到食品中。對(duì)在食品中人為添加三聚氰胺的，依法追究法律責(zé)任。三聚氰胺作為化工原料，可用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料的生產(chǎn)。資料表明，三聚氰胺可能從環(huán)境、食品包裝材料等途徑進(jìn)入到食品中，其含量很低。據(jù)醫(yī)學(xué)專家介紹，三聚氰胺是一種低毒性化工產(chǎn)品，嬰幼兒大量攝入會(huì)引起泌尿系統(tǒng)疾患。,49,圖中，橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比（m/z）值，從

26、左到右質(zhì)荷比的值增大，對(duì)于帶有單電荷的離子，橫坐標(biāo)表示的數(shù)值即為離子的質(zhì)量；,50,,超高效液相色譜法：在奶粉樣品中加入三氯乙酸和醋酸鉛溶液使蛋白質(zhì)部分沉淀，過(guò)混合型陽(yáng)離子交換柱(MCX) 純化, 離心后用0. 45μm 濾膜過(guò)濾, 用超高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC2MS2MS) 分析測(cè)定。 優(yōu)缺點(diǎn)：該法測(cè)定低含量三聚氰胺成份靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，但儀器昂貴。

27、,51,,氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法：樣品經(jīng)三氯乙酸使蛋白沉淀離心后過(guò)MCX固相萃取柱凈化,氮?dú)獯蹈?、硅烷化衍?再由氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。 優(yōu)缺點(diǎn)：試劑用量少，精確度高，安全可行，但必須經(jīng)過(guò)復(fù)雜的衍生步驟，操作繁瑣，工作效率低。,52,儀器結(jié)構(gòu),色譜-四極桿質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖,53,,注意：進(jìn)行GC-MS分析的樣品應(yīng)是有機(jī)溶液，水溶液中的有機(jī)物一般不能測(cè)定，須進(jìn)行萃取分離變?yōu)橛袡C(jī)溶液，或采用頂空進(jìn)樣技術(shù)

28、。有些化合物極性太強(qiáng)，在加熱過(guò)程中易分解，例如有機(jī)酸類化合物，此時(shí)可以進(jìn)行酯化處理，將酸變?yōu)轷ピ龠M(jìn)行GC-MS分析，由分析結(jié)果可以推測(cè)酸的結(jié)構(gòu)。如果樣品不能汽化也不能酯化，那就只能進(jìn)行LC-MS分析了。,54,,據(jù)統(tǒng)計(jì)，已知化合物中約80%的化合物是親水性強(qiáng)、揮發(fā)性低的有機(jī)物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子，這些化合物的分析不適宜用氣相色譜分析，只能依靠液相色譜。,55,簡(jiǎn)介 1977年，LC/MS開(kāi)始投放市場(chǎng)1978年，LC/MS首次

29、用于生物樣品分析1984年 第一臺(tái)電噴霧MS儀宣告誕生1988年 電噴霧離子源MS 首次應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析,二、液質(zhì)聯(lián)用儀LC-MS,56,2002年美國(guó)質(zhì)譜協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)的藥物色譜分析各種不同方法所占的比例。1990年，HPLC高達(dá)85%，而2000年下降到15%，相反，LC/MS所占的份額從3%提高到大約80%。,57,LC-MS要解決的重要問(wèn)題,由于LC的一些特點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)聯(lián)用時(shí)所遇到的困難比GC-MS大得多。,液相色譜流動(dòng)相流速一般

30、為1mL?min -1，如果流動(dòng)相為甲醇，其氣化后換成常壓下的氣體流速為560 mL? min -1 ，這比氣相色譜流動(dòng)相的流速大幾十倍。因此，在進(jìn)入質(zhì)譜計(jì)前必須要先清除流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜儀的影響。,58,質(zhì)譜離子源溫度對(duì)液相色譜分析源的影響液相色譜的分析對(duì)象主要是難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定物質(zhì)，這與質(zhì)譜儀中常用的離子源要求樣品汽化是不相適應(yīng)的，這使得由液相轉(zhuǎn)化為氣相的任務(wù)更具有挑戰(zhàn)性，尤其是要保證組分的完整性。,59,,液質(zhì)聯(lián)用的接口必須要解決三個(gè)

31、主要的問(wèn)題,1.去除溶劑 2.保留樣品3.電離化合物,60,液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)主要是沿著三個(gè)分支發(fā)展的：,（1）流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜直接離子化，形成了連續(xù)流動(dòng)快原子轟擊技術(shù)等；（2）流動(dòng)相霧化后除去溶劑，分析物蒸發(fā)后再離子化，形成了“傳送帶式”接口和離子束接口等；（3）流動(dòng)相霧化后形成的小液滴解溶劑化，氣相離子化或者離子蒸發(fā)后再離子化，形成了熱噴霧接口、大氣壓化學(xué)離子化和電噴霧離子化技術(shù)等。,61,目前，LC-MS最常用的二種連

32、接方式是電噴霧離子化（ESI）法、大氣壓化學(xué)電離（APCI）法。,LC-MS的連接方式,62,大氣壓化學(xué)離子源(APCI),電噴霧離子源(ESI),63,ESI工作原理,電噴霧電離是在液滴變成蒸汽，產(chǎn)生離子發(fā)射的過(guò)程中形成的，溶劑由液相泵輸送到ESI探針，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細(xì)管流出，這時(shí)給毛細(xì)管加2-4 KV的高壓，由于高壓和霧化氣的作用，流動(dòng)相從毛細(xì)管頂端流出時(shí)，會(huì)形成扇狀噴霧，使液滴生成含有樣品和溶劑離子的氣溶膠。,64,,ESI 源

33、主要由五部分組成：（1）流動(dòng)相導(dǎo)入裝置；（2）真正的大氣壓離子化區(qū)域，通過(guò)大氣壓離子化產(chǎn)生離子；（3）離子取樣孔；（4）大氣壓到真空的界面；（5）離子光學(xué)系統(tǒng)，該區(qū)域的離子隨后進(jìn)入質(zhì)量分析器。,65,66,ESI將離子從液相轉(zhuǎn)化到氣相的基本過(guò)程如下：,67,1. 在噴霧毛細(xì)管尖端產(chǎn)生帶電霧滴;　　2. 通過(guò)溶劑蒸發(fā)和霧滴分裂使帶電霧滴變小，反復(fù)進(jìn)行直到很小的帶電霧滴?！　?. 由很小的帶電霧滴產(chǎn)生氣相離子。,68,ESI適用于容易

34、在溶液中形成離子的樣品或極性化合物。因具有多電荷能力，所以其分析的分子量范圍很大，既可用于小分子分析，又可用于多肽、蛋白質(zhì)和寡聚核苷酸分析。,69,優(yōu)點(diǎn)：具有高的離子化效率，對(duì)蛋白質(zhì)而言接近100%；離子化模式多，正負(fù)離子模式均可以分析 ；穩(wěn)定的多電荷離子的產(chǎn)生，使分子量測(cè)定范圍可高達(dá)幾十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)；“ 軟”離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰；通過(guò)調(diào)節(jié)離子源電壓，可以控制離子的斷裂，給出結(jié)構(gòu)信息。,

35、70,,缺點(diǎn)：流速受限 0.2 mL 最大流速1 mL/min,71,APCI是在大氣壓下利用電暈放電來(lái)使氣相樣品和流動(dòng)相電離的一種離子化技術(shù)，要求樣品有一定的揮發(fā)性，適用于非極性或低、中等極性的化合物。由于極少形成多電荷離子，分析的分子量范圍受到質(zhì)量分析器質(zhì)量范圍的限制。,72,在APCI中，樣品溶液是借助于霧化器的作用，噴入高溫（500度）的蒸發(fā)器，此時(shí)，溶劑和溶質(zhì)均成為蒸汽。氣化的樣品分子經(jīng)化學(xué)離子化生成氣相離子。,73,APC

36、I優(yōu)點(diǎn)∶,1.利用所得到[M+1]+及[M-1]–進(jìn)行分子量確認(rèn) 2.源參數(shù)調(diào)整簡(jiǎn)單，容易使用 3.耐受性好，噴霧器及針的位置不關(guān)鍵 4.LC流速可達(dá)2.0 mL/min 5.好的靈敏度,74,,缺點(diǎn)： 1.有限的結(jié)構(gòu)信息 2.易發(fā)生熱裂解 3.低質(zhì)量時(shí)化學(xué)噪聲大 4.不適合做分子量大于1000的化合物,75,ESI和APCI比較,共同點(diǎn)：&

37、#160; 1、使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生離子 2、通常產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-等準(zhǔn)分子離子 3、產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片 ４、非常靈敏的電離技術(shù),76,不同點(diǎn)：  1、生成離子的方式不同，ESI：液相離子化；APCI：氣相離子化  2、樣品兼容性 ESI：極性化合物和生物大分子； APCI：非極

38、性，小分子化合物（相對(duì)ESI而言）且有一定揮發(fā)性  3、流速兼容性 ESI：0.001到1ml/min； APCI：0.2到2ml/min  4、ESI的適用范圍要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于APCI,77,LC-MS (四極桿)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖,,78,大氣壓光離子化源 (APPI),新的大氣壓離子化技術(shù)使用紫外光代替corona電暈放電方法進(jìn)行氣態(tài)化合物離子化采用高輸出通量的氣體放

39、電管輸出紫外光,,,Capillary,,HPLC inlet,Nebulizer,,Vaporizer (heater),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Drying gas,,,,UV Lamp,,79,多環(huán)芳烴的液質(zhì)分析結(jié)果,80,ESI與APCI 離子源的選擇,ESI適合范圍廣:分析離子型/極性化合物、難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定性化合物易

40、形成多電荷離子，可以分析高分子量化合物 靈敏度高離子化受溶劑、流速的影響,APCI有一定揮發(fā)性的中等極性或低極性的小分子化合物對(duì)溶劑選擇、流速和添加物的依賴性較小,81,不同離子源可能都有響應(yīng)，但響應(yīng)值不同,82,ESI和APCI是互補(bǔ)的。熱不穩(wěn)定的或難于氣化的極性化合物適合于ESI分析。在ESI中，如樣品具有酸、堿性，則樣品分子在溶液中可去質(zhì)子生成陰離子或者接受質(zhì)子成為陽(yáng)離子，或者與Na+形成加合離子。APCI適合于小分子極性

41、較低的化合物，如醇和醚類。,83,,APCI不涉及溶液化學(xué)，操作容易。此外，正相色譜通常易于與APCI連接。非極性溶劑和溶液易于蒸發(fā)，烷烴溶劑生成的試劑離子是強(qiáng)氣相酸，易于將質(zhì)子轉(zhuǎn)移至樣品分子。,84,85,,SSI 音噴離子化接口技術(shù)是于1994 年發(fā)展起來(lái)的新型接口技術(shù) , 它可適用于毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用及液質(zhì)聯(lián)用的分析, 目前主要用于分析殺蟲(chóng)藥和蛋白質(zhì) 。,86,,在進(jìn)行LC-MS分析時(shí)，樣品可以利用旋轉(zhuǎn)六通閥通過(guò)LC進(jìn)樣，也可以利

42、用注射泵直接進(jìn)樣，樣品在電噴霧源或大氣壓化學(xué)電離源中被電離，經(jīng)質(zhì)譜掃描，由計(jì)算機(jī)可以采集到總離子色譜和質(zhì)譜。,87,LC-MS分析條件的選擇,88,2.正負(fù)離子模式的選擇,正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH＝3-4）或甲酸（pH＝2-3）對(duì)樣品加以酸化。負(fù)離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。有些酸堿性并不明確的化合物，可優(yōu)先選用APCI（+）進(jìn)行測(cè)定。,89,在LC和MS聯(lián)用的情況下，由于要考慮噴霧霧化和電

43、離，因此，有些溶劑不適合于作流動(dòng)相。在LC-MS分析中常用的溶劑和緩沖液有水，甲醇、甲酸、乙酸、氫氧化銨和乙酸銨等。對(duì)于選定的溶劑體系，通過(guò)調(diào)整溶劑比例和流量以實(shí)現(xiàn)好的分離。,3.流動(dòng)相的選擇,90,常用的溶劑和緩沖液a 水、乙腈及甲醇 LC-MS理想的溶劑b 乙酸和甲酸 可降低LC流動(dòng)相的pH值以提高分離度c 氫氧化銨/氨溶液 可提高LC流動(dòng)相的pH值d 乙酸銨 是一種揮發(fā)性鹽，用于緩沖流動(dòng)相，并改善色譜分離而不影響MS

44、的性能。最大濃度不超過(guò)0.1mol/L。,91,不適合的溶劑和緩沖液a 不揮發(fā)的鹽，在離子源內(nèi)析出結(jié)晶，b 表面活性劑/洗滌劑，會(huì)抑制其它化合物電離c 無(wú)機(jī)酸,92,與GC-MS類似，LC-MS也可以通過(guò)采集質(zhì)譜得到總離子色譜圖,93,94,苯二氮卓類（Benzodiazepines ）的分析,三唑(Triazolam),安定(Diazepam),12.5 ng/component,,,95,96,97,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)

45、用,LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。大量有機(jī)合成中間體、藥物代謝物、基因工程產(chǎn)品等的分析結(jié)果，為生產(chǎn)和科研提供了許多有價(jià)值的數(shù)據(jù)，解決了許多在此之前難以解決的問(wèn)題。,98,Agilent 1100 LC/MS TRAP應(yīng)用范圍,在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用在農(nóng)藥合成及農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用在染料(如偶氮染料)分析中的應(yīng)用;表面活性劑分析中的應(yīng)用;在高分子添加劑分析

46、中應(yīng)用在雙酚A,壬基酚及表面活性劑分析中的應(yīng)用在食品中獸藥殘留和毒素分析中的應(yīng)用在食品及飲用水中農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用天然產(chǎn)物分析或中草藥的品質(zhì)控制化妝品中違禁激素的測(cè)定保健食品中違禁藥物的檢測(cè),99,藥物代謝研究,藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進(jìn)展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/ml~pg/ml），高選擇性（

47、檢測(cè)特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測(cè)幾百個(gè)生物樣品和對(duì)藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對(duì)液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過(guò)二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復(fù)雜生物樣品的自動(dòng)化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測(cè)試的樣品量占總量的70%以上。,100,天然產(chǎn)物天然藥物的研究,目前中藥開(kāi)發(fā)研究有兩

48、條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開(kāi)發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)研究。 采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可對(duì)其十幾種乃至幾十種化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜分離鑒定。再?gòu)闹讣y圖譜中選擇四、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分)進(jìn)行定量，可以確定出簡(jiǎn)化的指紋圖譜和指標(biāo)成分，又是最合理的中藥復(fù)方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方的

49、有力工具。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開(kāi)靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。,101,臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析,歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標(biāo)志物的研究、檢測(cè)，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟(jì)效益可觀等特點(diǎn)。目前可進(jìn)行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測(cè)、男女激素的監(jiān)測(cè)、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測(cè)、磷酸脂的檢

50、測(cè)、血紅蛋白變異檢測(cè)、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測(cè)）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過(guò)鑒定DNA損傷程度測(cè)定）、藥物劑量監(jiān)測(cè)、藥物相互作用監(jiān)測(cè)、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測(cè)等。,102,殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測(cè)定,專家指出，中國(guó)入世后，食品工業(yè)最大的問(wèn)題就是"安全壁壘"，這將給中國(guó)的進(jìn)出口和國(guó)內(nèi)企業(yè)帶來(lái)極大的威脅。美國(guó)食品與藥品管理局 (FDA)、歐盟、日本、韓國(guó)等主要貿(mào)易國(guó)和地區(qū)公

51、布了在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。這就要求中國(guó)加強(qiáng)農(nóng)、畜、水產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥等殘留的控制和檢測(cè)。 同樣隨著人類對(duì)生存環(huán)境的倍加關(guān)注，要求對(duì)環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術(shù)的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用與殘留和毒物分析。目前已成功地進(jìn)行數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留

52、和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測(cè)。,103,電噴霧正離子模式, 全掃描,法莫替丁(Famotidine)中的雜質(zhì)分析,,104,,舒喘寧（Salbutamol )降解產(chǎn)物分析,在藥物降解中,降解產(chǎn)物可能保留了紫外發(fā)光基團(tuán),其紫外光譜圖類似,所以無(wú)法通過(guò)紫外來(lái)對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,而利用質(zhì)譜則通過(guò)質(zhì)譜圖可以鑒定降解產(chǎn)物,UV Signal and spectra,MS TIC and EICs,105

53、,磺胺藥物分析,,sulfamethizoleMW 270,sulfadimethoxineMW 310,sulfachloropyridazineMW 284,sulfamethazineMW 278,,,共流出峰的鑒定,106,甲基橙染料降解產(chǎn)物的分析,107,Ｍass spectra of methyl orange degradation products,108,Fragmentation scheme of meth

54、yl orange degradation products.,109,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,GC-MS是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用EI得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比。 LC-MS主要可解決如下幾方面的問(wèn)題：不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測(cè)定；沒(méi)有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析譜圖