酶分子修飾

1、第十二章 酶分子修飾,一、酶分子修飾的原因,酶在生物技術(shù)中占有核心地位酶具有反應(yīng)專一性、催化效率高及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面得到越來越多的應(yīng)用。,大規(guī)模應(yīng)用的酶及酶工藝尚不夠多，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是多方面的，這主要表現(xiàn)在：(1) 穩(wěn)定性酶是生物活性大分子。一旦離開生物細(xì)胞，離開其本身特定的作用環(huán)境，在發(fā)酵分離提純、反應(yīng)、制劑及固定化等過程中，常常顯得不夠穩(wěn)定，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。,（2）作用的最適

2、條件（pH中性、室溫，溶液狀態(tài)） 一般酶反應(yīng)是在基本接近中性，與室溫相距不大的水溶液中進(jìn)行的。在工業(yè)應(yīng)用上，由于產(chǎn)物、底物帶來的影響，作用時(shí)的pH常常不在中性范圍內(nèi)。溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快，但酶往往不穩(wěn)定，如果降低溫度，又影響反應(yīng)速度。底物不溶于水時(shí)，酶就更難發(fā)揮作用。,（3）酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng) （Km值大，與底物的親和力?。┟资铣?shù)Km值過大，使反應(yīng)在低底物濃度下不能高速進(jìn)行，由于體內(nèi)各種代謝物質(zhì)的濃度

3、較低，對Km較大的酶用于臨床檢測或治療時(shí)，影響就更大。,（4）臨床應(yīng)用的特殊要求絕大多數(shù)酶來自動(dòng)、植物及微生物，對人體來說這些酶都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，都有可能引起人體的過敏反應(yīng)。酶進(jìn)入人體后也常會(huì)由于一些蛋白酶、抑制劑或抗體的作用而失去其活力，特別是當(dāng)酶進(jìn)入體內(nèi)以后不能迅速到達(dá)或集中于病灶時(shí)，這種情況尤為明顯。,（一） 如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性?（二）如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑?（三）如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性

4、與抗蛋白水解酶?（四）如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境?,總結(jié): 解決的問題 ？,二、酶的分子工程,（一）基本內(nèi)容 1、酶分子改造： 對酶蛋白的主鏈“切割”，即根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究，通過一種相應(yīng)的方法，去掉酶分子那些與活性無關(guān)而有礙應(yīng)用的部分，提高其活性，增加穩(wěn)定性。 2、酶分子模擬： 根據(jù)酶作用原理的研究，模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)合成的方法制備高效、專一、分子較簡單、較穩(wěn)定的新型催化

5、劑。（模擬酶）,3、酶的化學(xué)修飾： 即在體外將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。,（二）酶的分子工程分類 1、分子生物學(xué)水平利用工程方法對DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶蛋白。,2、蛋白質(zhì)水平 通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的結(jié)構(gòu)。人們用化學(xué)法或酶法對酶的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。包括酶的一級結(jié)構(gòu)

6、中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定。另一方面是對酶分子中氨基酸殘基的修飾，即酶的化學(xué)修飾。,5.1 什么是酶分子修飾？,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。,酶分子修飾的意義,提高酶的催化效率增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和

7、各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structure,5.2 酶分子修飾的基本要求和條件,對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。,5.3 酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾核

8、苷酸鏈剪切修飾氨基酸置換修飾核苷酸置換修飾酶分子的物理修飾,,第一節(jié) 金屬離子置換修飾 一、 概念 通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。,二、作用范圍含有金屬離子的酶 金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。（ 1 ）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（ 2 ）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)

9、不同特性。,超氧化物歧化酶（SOD）分子中的Cu2+、Zn2+,,金屬離子置換修飾的過程,a. 酶的分離純化： b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。 c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子

10、，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。,作用：,1、闡明金屬離子對酶作用的影響2、提高酶活力 如:將其它雜離子型的α-淀粉酶都換成鈣離子型,會(huì)提高酶活力與穩(wěn)定性;結(jié)晶鈣型α-淀粉酶活力比一般結(jié)晶雜離子型α-淀粉酶活力提高3倍以上，穩(wěn)定性也大增。 蛋白酶(鋅型，Zn2+): 用Ca2+置換Zn2+成鈣型蛋白

11、酶，鈣型蛋白酶活性提高20~30%。 3、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 如: Fe-SOD→Mn-SOD,對H2O2穩(wěn)定性增強(qiáng),對NaN3敏感性顯著降低.,4、改變酶的動(dòng)力學(xué)特性包括Km與最適pH和最適溫度等,四、常用的金屬離子二價(jià)離子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。,第2節(jié) 大分子結(jié)合修飾,利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分

12、子結(jié)合修飾法，簡稱為大分子結(jié)合法。目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法。,大分子修飾的過程,1、修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。,PEG應(yīng)用最為廣泛溶解度高，既能溶解于水，也能溶解大多數(shù)有機(jī)溶劑通常沒有抗原性也沒有毒性生物相溶性好分子末端具有兩個(gè)可以被

13、活化的羥基，可以通過甲氧基化將其中一個(gè)羥基屏蔽起來，成為只有一個(gè)可被活化羥基的單甲氧基聚乙二醇（MPEG）。,常用的大分子修飾劑單甲氧基聚乙二醇（MPEG）可以采用多種不同的試劑進(jìn)行活化，制成可以在不同條件下對酶分子上不同基因進(jìn)行修飾的聚乙二醇衍生物。,2、修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。,3、修飾：將帶有活化基團(tuán)的大

14、分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。,,4）分離： 通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。,二、大分子結(jié)合修飾的作用,提高酶催化效率:每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶催化效率達(dá)到原有酶活力的5.1倍等。增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性：利用聚乙二醇修飾SOD

15、可將其相對穩(wěn)定性提高350倍。降低或消除酶蛋白的抗原:利用水溶性大分子對酶進(jìn)行修飾，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇（PEG）結(jié)合修飾后，其抗原性顯著降低；用聚乙二醇對色氨酸酶進(jìn)行修飾，可完全消除該酶的抗原性；聚乙二醇結(jié)合修飾后的L-天門冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。,采用一定的方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能，這種酶分子修飾方法稱為酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾。由于酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾

16、一般采用化學(xué)手段，故屬于化學(xué)修飾法。,第三節(jié) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,在酶學(xué)方面可以用于研究酶分子的結(jié)構(gòu)和功能，可以測定某一種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量。在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶的催化特性和催化功能的改變，以提高酶的使用價(jià)值。還可能獲得自然界原來不存在的新酶種，如某些抗體酶和人工改造的核酸類酶等。,酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)，主要包括：,氨基羧基巰基胍基

17、酚基吲哚基咪唑基,各種小分子修飾劑雙功能團(tuán)的化合物進(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾， 如戊二醛、己二胺等各種大分子與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)形成共 價(jià)鍵而進(jìn)行大分子結(jié)合修飾,修飾方法,一、氨基的化學(xué)修飾,常用氨基修飾試劑：亞硝酸、醋酸酐、琥珀酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、２,４-二硝基氟苯（DNFB）、碘代乙酸、丹磺酰氯（DNS）、O-甲基異脲。,R-CH-COOH + HNO2 = R-CH-COOH + N2 + H2

18、O | | NH2 OH,如用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽鏈中的賴氨酸殘基上的氨基產(chǎn)生脫胺作用，變成羥基。經(jīng)過修飾后，酶的穩(wěn)定性大大提高，使其在體內(nèi)的半衰期延長2倍。,２，４-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）（又稱二甲氨基萘磺酰氯）,可以專一地與多肽鏈N端氨基酸殘基的氨基反應(yīng)。據(jù)此

19、可以進(jìn)行肽鏈的N端氨基酸的檢測。,二、羧基的化學(xué)修飾,常用羧基修飾試劑：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異唑鹽等,E-C-OH + R-N=C=N-R’ = E-C-O-C=N-R || || | O O NH-R’ 酶 碳二亞胺

20、酶碳二亞胺衍生物,碳二亞胺是酶分子羧基修飾最普遍采用的修飾劑。用此修飾法可以定量測定酶分子中羧基的數(shù)目。,三、巰基修飾,巰基的親核性很強(qiáng)，是酶分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)之一。通過巰基修飾，往往可以顯著提高酶的穩(wěn)定性。常用的巰基試劑有酰化劑、烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉。,其中烷基化試劑（如碘乙酸等）是一種重要的巰基修飾劑，經(jīng)過烷基化修飾的酶分子相當(dāng)穩(wěn)定，而且通過熒光檢測技術(shù)很容易檢測其修飾結(jié)果。現(xiàn)

21、在已經(jīng)開發(fā)出許多含有碘乙酸的熒光試劑。,E-SH+ICH2COOH = E-S-CH2COOH+HI 酶 碘乙酸 酶-乙酸衍生物,N-乙基馬來酰亞胺（NEM）是一種反應(yīng)專一性很強(qiáng)的巰基修飾劑,能與酶分子的巰基形成穩(wěn)定的衍生物,反應(yīng)產(chǎn)物在300nm處有最大光吸收。,,四、胍基修飾,精氨酸含有胍基。胍基可與二羰基化合物縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。所以二羰基化合物，如環(huán)已二酮、丙二醛、苯乙二醛等，都可以用作胍基修飾劑。經(jīng)過

22、胍基修飾后的酶蛋白，其空間構(gòu)象將有所改變。,五、酚基修飾,酚基的修飾包括酚羥基的修飾和苯環(huán)上的取代修飾。酚基修飾的方法主要有碘化法、消化法、琥珀?；ǖ取Ｆ渲兴南趸淄椋═NM）可以高度專一地對酚羥基進(jìn)行修飾。,例如，枯草桿菌蛋白酶的第104位酪氨酸殘基上的酚基經(jīng)四硝基甲烷消化修飾后，生成3-硝基酪氨酸殘基，由于負(fù)電荷的引入，使酶對帶正電荷的底物的結(jié)合力顯著增加。,六、咪唑基修飾,常用的咪唑基修飾劑有碘乙酸、焦碳酸二乙酯等。,七、吲哚

23、基修飾,色氨酸殘基由于其疏水性較強(qiáng)，通常位于酶分子的內(nèi)部。而且比較不活潑，其反應(yīng)性比較差。所以一般的試劑難于對吲哚基進(jìn)行修飾。,八、分子內(nèi)交聯(lián)修飾,通過分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定，從而提高酶分子的穩(wěn)定性。例如，采用葡聚糖二乙醛對青霉素?；高M(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使該酶在55℃條件下的半衰期延長9倍，而其最大反應(yīng)速度不改變。,采用雙功能基團(tuán)化合物與酶分子相距相近兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價(jià)交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾

24、方法,雙功能基團(tuán)化合物根據(jù)其功能基團(tuán)的特點(diǎn)可以分為：,同型雙功能基團(tuán)化合物的兩端具有相同的功能基團(tuán),OHC-（CH2）3-CHO,異型雙功能基團(tuán)化合物的兩端具有不相同的功能基團(tuán),值得注意的是分子內(nèi)交聯(lián)是在同一個(gè)酶分子內(nèi)進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)，如果雙功能試劑的2個(gè)功能團(tuán)分別在2個(gè)酶分子之間或在酶分子與其他分子之間進(jìn)行交聯(lián)，則可以使酶的水溶性降低，成為不 溶于水的固定化酶，謂之交聯(lián)固定化。,第三節(jié)：肽鏈有限水解修飾,酶的催化功能主要決定于酶的活性中

25、心的構(gòu)象，活性中心部位的肽段對酶的催化作用是必不可少的，而活性中心以外的肽段起到維持酶的空間構(gòu)象的作用。,酶蛋白的肽鏈被水解以后，將可能出現(xiàn)以下3種情況中的一種：若肽鏈水解后引起酶活性中心的破壞，則酶將失去其催化功能；若將肽鏈的一部分水解后，仍可維持其活性中心的完整構(gòu)象，則酶的活力仍可保持或損失不多；若肽鏈的一部分水解除去以后，有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催化部位的話，則酶可顯示出其催化功能或使酶活力提高。

26、 在后兩種情況下，利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。,,N端,a、胃蛋白酶原的激活,天門冬氨酸酶通過胰蛋白酶進(jìn)行修飾，從其羧基末端水解切除10多個(gè)氨基酸殘基的肽段，可使天門冬氨酸酶的催化效率提高4—5倍以上。,若將酶分子經(jīng)肽鏈有限水解，其分子量減小，就會(huì)在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性顯著降低，甚至消失。例如：將木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，

27、使其全部肽鏈的三分之二被水解除去，該酶的酶活力保持不變，而其抗原性大大降低。又如：酵母的烯醇化酶經(jīng)有限水解除去由150個(gè)氨基酸組成的肽段后，酶活力仍可保持，抗原性卻顯著降低。,對酶進(jìn)行肽鏈有限水解，通常使用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑。此外也可采用其他方法使肽鏈部分水解，達(dá)到修飾目的。例如，枯草桿菌中性蛋白酶，先用EDTA處理，再經(jīng)純水或稀鹽緩沖液透析，可使該酶部分水解，得到仍有蛋白酶活性的小分子肽段，用作消炎劑使用時(shí)，不產(chǎn)

28、生抗原性，表現(xiàn)出良好的治療效果。,第四節(jié)：氨基酸置換修飾,若將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，則會(huì)引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的某些特性和功能，這種修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。,一、氨基酸置換修飾的作用,◆提高酶催化效率： 酪氨酸—tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所對應(yīng)tRNA合成酪氨酰tRNA，若將該酶第51位的蘇氨酸（Thr51）由脯氨酸置換，修飾后的酶對ATP的親和性提高近100倍，催化效率提高25倍。

29、 ◆增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 T4—溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸(ILu—3）換成半胱氨酸后，該半胱氨酸(Cys—3)可與第97位的半胱氨酸(Cys—97)形成二硫鍵，氨基酸置換修飾后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高?！羰姑傅膶Ｒ恍园l(fā)生改變,二、氨基酸置換修飾的方法,化學(xué)修飾法： 例如：Bender和kosland成功地利用化學(xué)方法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，經(jīng)修

30、飾后，該酶對蛋白質(zhì)和肽的水解能力消失，但卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)方法進(jìn)行氨基酸置換，難度較大，受到諸多限制，難于工業(yè)化生產(chǎn)。,定點(diǎn)突變技術(shù)：（site directed mutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。

31、定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。,,酶分子的定點(diǎn)突變,1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析,第五節(jié)：酶分子的物理修飾,通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為物理修飾。,◇可以了解在不同的物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下，由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能

32、的變化情況。◇還可能提高酶的催化活性，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性或者是酶的催化動(dòng)力學(xué)特性發(fā)生某些改變。,例如：羧化酶經(jīng)高壓處理后，底物特異性發(fā)生改變，有利于催化肽的合成反應(yīng)，而水解反應(yīng)的能力降低；用高壓方法處理纖維素酶以后．該酶的最適溫度有所降低，在30-40℃的條件下，高壓修飾酶比天然酶的活力提高10％。,特點(diǎn)：不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。,第六節(jié) 核苷酸鏈剪切修飾及置

33、換修飾,在核苷酸的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以改變酶的催化特性。這種方法稱為核苷酸鏈剪切修飾（例如四膜蟲26SRNA前體經(jīng)過經(jīng)自我剪接形成成熟的多功能核酸類酶L-19IVS。將酶分子核苷酸鏈的特定的核苷酸替換為另一個(gè)核苷酸，從而使酶的催化特性改變。這種方法稱為核苷酸鏈置換修飾.置換修飾。,核酸類酶：主要由核苷酸組成。,第七節(jié) 酶分子修飾的應(yīng)用,在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用在醫(yī)藥方面的應(yīng)用在工業(yè)方面的應(yīng)用在抗體酶研究方面

34、的應(yīng)用在核酸類酶人工改造在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,從20世紀(jì)50年代開始，酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾已經(jīng)成為生物化學(xué)和酶學(xué)研究的熱門課題。主要用于研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。對酶學(xué)的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)。,在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用,酶的活性中心研究酶的空間結(jié)構(gòu)研究酶的作用機(jī)制研究,★ 增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性 T4—溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸(ILu—3）換成半胱氨酸后，該半胱氨酸(Cys—3)可與第97位的半胱氨酸(Cys—97)

35、形成二硫鍵，氨基酸置換修飾后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。,★ 降低或消除酶抗原性 具有抗癌作用的精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾，其抗原性被消除； 對白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾后，使抗原性顯著降低甚至消除。1994年正式作為治療急性淋巴性白血病的藥物在臨床使用。,在醫(yī)藥方面的應(yīng)用：,超氧化物歧化酶，經(jīng)過大分子結(jié)合修飾，形成聚乙二醇-超氧化物歧化酶

36、（PEG-SOD），其穩(wěn)定性顯著提高，在血漿中的半衰期可以延長350倍。采用葡聚糖二乙醛對青霉素酰化酶進(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使該酶在55℃條件下的半衰期延長9倍，而其最大反應(yīng)速度不改變。用亞硝酸修飾L-天冬酰胺酶，使其氨基變成羥基。經(jīng)過修飾后，酶的穩(wěn)定性大大提高，在體內(nèi)的半衰期延長2倍。,■提高工業(yè)用酶的催化效率 采用大分子結(jié)合修飾，使每分子胰蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力可以達(dá)到原有酶活力的5.1倍。

37、,在工業(yè)方面的應(yīng)用：,通過金屬離子置換修飾，將雜離子型α-淀粉酶全部置換為鈣型α-淀粉酶，其催酶化效率可以提高3倍以上，而且穩(wěn)定性大大增加。故此，在α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過程中，添加一定量的鈣離子，有利于提高α-淀粉酶的活力和穩(wěn)定性。,■增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性,■改變酶的動(dòng)力學(xué)特性,,經(jīng)過琥珀酰化修飾后，葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值下降0.5，并增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，更加有利于果葡糖漿和果糖的生產(chǎn)。,如果對酶分子進(jìn)行側(cè)鏈基團(tuán)修飾，使酶分子

38、表面的基團(tuán)增強(qiáng)疏水性，就可能使酶溶解于有機(jī)溶劑，均勻地分布于溶劑中，就有可能提高酶的催化效率和穩(wěn)定性。,例如，采用單甲氧基聚乙二醇對脂肪酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等酶分子表面上的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合修飾，得到的修飾酶能夠均一地溶解于苯和氯仿等有機(jī)溶劑中，并具有較高的催化活性和穩(wěn)定性。,在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,在抗體酶開發(fā)中的應(yīng)用在核酸類酶改造中的應(yīng)用,作業(yè),何謂金屬離子修飾？如何進(jìn)行金屬離子修飾？何謂大分子結(jié)合修飾，如何進(jìn)行大分子