抗腫瘤藥物的酶法鼠李糖基化修飾及α-l-鼠李糖苷酶的分子改造.pdf

1、糖苷酶，即糖苷水解酶(glycosidase，glycoside hydrolase，EC3.2.1)，在動(dòng)物、植物和微生物中普遍存在，能夠水解糖苷鍵，同時(shí)一些糖苷酶在體外還具有催化糖苷合成的能力。這類酶的優(yōu)點(diǎn)是酶源豐富、性質(zhì)十分穩(wěn)定、反應(yīng)途徑簡(jiǎn)單而且底物價(jià)格低廉，對(duì)糖苷合成的催化不僅具有嚴(yán)格的立體專一性還具有一定的區(qū)域選擇性，因此是催化糖苷合成的重要工具。
　　α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1

2、.40)能夠使糖苷化合物非還原端的α-L-鼠李糖苷鍵發(fā)生斷裂，是重要的糖苷水解酶類，其中大部分屬于糖苷酶78家族，大多為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)酶類。天然存在的簡(jiǎn)單和復(fù)雜的α-L-鼠李糖苷分子（如人參皂苷、柚苷、橙皮苷等）都能被α-L-鼠李糖苷酶水解，其中一些α-L-鼠李糖苷酶還能以鼠李糖為供體通過(guò)逆水解反應(yīng)催化鼠李糖苷的合成，在制藥、化學(xué)和食品等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的分離純化和水解活性的利用是目前國(guó)際上α-L-鼠李糖苷酶的研究熱點(diǎn)，但

3、是有關(guān)α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆、重組表達(dá)、催化糖苷合成和分子改造方面的研究還較少。
　　研究表明某些腫瘤細(xì)胞表面存在鼠李糖凝集素，能夠特異性地結(jié)合鼠李糖?？鼓[瘤藥物的糖基化修飾會(huì)增強(qiáng)藥物的靶向性、減少對(duì)正常細(xì)胞的損害、減少藥物給劑量以及提高療效，而且還可以用來(lái)研究不同腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性。鼠李糖基化合物是一類含有鼠李糖基的化合物，一般是單個(gè)或多個(gè)鼠李糖基通過(guò)不同鍵型糖苷鍵連接到多種受體（單糖、寡糖、烷基、皂苷和生物堿等）分子上

4、所形成的，不僅具有良好的生物活性，而且具有重要的生物學(xué)功能。鼠李糖基化合物在天然化合物（如糖蛋白及花青素、植物細(xì)胞壁、類黃酮和三萜烯類等）中普遍存在，在多糖抗原結(jié)構(gòu)如鼠李糖脂、細(xì)菌雜多糖和細(xì)菌外膜脂的重復(fù)單元中也很普遍。從天然原料中提取和化學(xué)法合成鼠李糖基化合物的缺點(diǎn)是步驟繁瑣導(dǎo)致得率較低，并且不利于人類健康和環(huán)境保護(hù)。而酶法合成鼠李糖基化合物的優(yōu)勢(shì)是不但具有嚴(yán)格的立體選擇性和一定的區(qū)域選擇性，而且反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境無(wú)害。
　　

5、本實(shí)驗(yàn)室前期從Alternaria sp.L1中分離純化了一種α-L-鼠李糖苷酶RhaL1，并且克隆了該酶基因。本論文利用該酶具有催化糖苷合成的能力，以鼠李糖為供體，兩種臨床抗腫瘤藥物羥基脲和5-氟-2'-脫氧脲核苷為受體，通過(guò)逆水解反應(yīng)催化合成了抗腫瘤藥物的鼠李糖苷化合物。合成產(chǎn)物通過(guò)凝膠過(guò)濾層和高效液相色譜進(jìn)行分離、純化，質(zhì)譜鑒定了羥基脲鼠李糖苷和5-氟-2'-脫氧脲核苷鼠李糖苷的分子量，核磁共振解析了產(chǎn)物5-氟-2'-脫氧脲核苷鼠

6、李糖苷結(jié)構(gòu)為3'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脫氧脲苷和5'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脫氧脲苷。但是該原始酶催化抗腫瘤藥物鼠李糖苷的產(chǎn)量比較低，我們計(jì)劃對(duì)其進(jìn)行分子改造以提高其催化效率。
　　本論文將Alternaria sp.L1的RhaL1與已知晶體結(jié)構(gòu)、來(lái)源于Streptomycesavermitilis的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A，蛋白晶體編號(hào)3w5n）進(jìn)行序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)出該酶的酸堿

7、催化位點(diǎn)分別為Asp257和Glu530。同時(shí)對(duì)結(jié)合有鼠李糖分子的RhaL1的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，經(jīng)過(guò)與SaRha78A比對(duì)，推測(cè)RhaL1的Asp252、Asp257、Asp264、 Trp369、Glu530、His553和Tyr302都能和鼠李糖分子形成直接或間接的氫鍵， Trp369、Trp261、Tyr316、和Pro366參與催化活性中心的疏水口袋的組成。根據(jù)鼠李糖苷酶的催化機(jī)制，我們推測(cè)這些氫鍵在穩(wěn)定底物（供體）及催化（糖苷

8、）合成反應(yīng)方面有重要作用，而酶活性中心疏水腔的結(jié)構(gòu)也與底物分子的穩(wěn)定性有關(guān)，根據(jù)距離供體分子的距離判斷可能與其發(fā)生相互作用的氨基酸還有Arg548和Trp555。采用Easy Mutagenesis System對(duì)上述氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得以下單點(diǎn)突變的突變酶:D252N、D252A、D257N、W261A、W261Y、D264N、D264A, Y302F, Y316F, W369A, W369Y, E530D, E530Q, R

9、548A, H553A,W555A，并通過(guò)畢赤酵母表達(dá)重組突變酶。其中突變酶D252N、D252A、D257N、W261A、D264N、D264A、W369A、E530D、E530Q同時(shí)喪失了水解活性和逆水解活性，突變酶W261Y、Y302F、Y316F、R548A、W555A保留了水解活性和逆水解活性，突變酶W369Y、H553A只保留了逆水解活性。對(duì)保留了逆水解活性的突變酶W261Y、Y302F、Y316F、W369Y、R548A、

10、H553A、W555A以甘露醇為受體進(jìn)行了鼠李糖苷合成反應(yīng)研究，對(duì)其逆水解產(chǎn)物進(jìn)行TLC和HPLC分析結(jié)果顯示突變酶Y316F、R548A與原始酶相比，糖苷合成產(chǎn)率均有所提高，其中突變酶Y316F催化糖苷合成的產(chǎn)率最高，比原始酶提高了57％。通過(guò)對(duì)RhaL1單點(diǎn)突變結(jié)果的分析了解到靠近供體分子異頭碳的氨基酸突變之后，酶會(huì)同時(shí)喪失水解活性和逆水解活性，而那些遠(yuǎn)離異頭碳特別是構(gòu)成疏水口袋的氨基酸突變之后，酶的水解活性和逆水解活性大多數(shù)情況下

11、不會(huì)喪失。因此為了提高酶的逆水解活性，應(yīng)該將酶的改造重點(diǎn)集中在遠(yuǎn)離異頭碳且對(duì)穩(wěn)定底物分子有重要作用的氨基酸上。
　　構(gòu)建pPIC9K/Y316F重組質(zhì)粒，在畢赤酵母KM71中高效表達(dá)突變酶Y316F，SDS-PAGE顯示重組蛋白的單亞基分子量為～120kDa，與預(yù)測(cè)分子量一致;突變酶Y316F對(duì)人工底物pNPR的Km值為0.52mM，Vmax為0.89nM/min，與原始酶相比對(duì)人工底物pNPR的親和力更強(qiáng)。突變酶Y316F的最適