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文檔簡介
1、糖苷酶,即糖苷水解酶(glycosidase,glycoside hydrolase,EC3.2.1),在動物、植物和微生物中普遍存在,能夠水解糖苷鍵,同時一些糖苷酶在體外還具有催化糖苷合成的能力。這類酶的優(yōu)點是酶源豐富、性質(zhì)十分穩(wěn)定、反應途徑簡單而且底物價格低廉,對糖苷合成的催化不僅具有嚴格的立體專一性還具有一定的區(qū)域選擇性,因此是催化糖苷合成的重要工具。
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC3.2.1
2、.40)能夠使糖苷化合物非還原端的α-L-鼠李糖苷鍵發(fā)生斷裂,是重要的糖苷水解酶類,其中大部分屬于糖苷酶78家族,大多為構型翻轉(zhuǎn)酶類。天然存在的簡單和復雜的α-L-鼠李糖苷分子(如人參皂苷、柚苷、橙皮苷等)都能被α-L-鼠李糖苷酶水解,其中一些α-L-鼠李糖苷酶還能以鼠李糖為供體通過逆水解反應催化鼠李糖苷的合成,在制藥、化學和食品等領域應用十分廣泛。產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的分離純化和水解活性的利用是目前國際上α-L-鼠李糖苷酶的研究熱點,但
3、是有關α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆、重組表達、催化糖苷合成和分子改造方面的研究還較少。
研究表明某些腫瘤細胞表面存在鼠李糖凝集素,能夠特異性地結合鼠李糖??鼓[瘤藥物的糖基化修飾會增強藥物的靶向性、減少對正常細胞的損害、減少藥物給劑量以及提高療效,而且還可以用來研究不同腫瘤細胞的藥物敏感性。鼠李糖基化合物是一類含有鼠李糖基的化合物,一般是單個或多個鼠李糖基通過不同鍵型糖苷鍵連接到多種受體(單糖、寡糖、烷基、皂苷和生物堿等)分子上
4、所形成的,不僅具有良好的生物活性,而且具有重要的生物學功能。鼠李糖基化合物在天然化合物(如糖蛋白及花青素、植物細胞壁、類黃酮和三萜烯類等)中普遍存在,在多糖抗原結構如鼠李糖脂、細菌雜多糖和細菌外膜脂的重復單元中也很普遍。從天然原料中提取和化學法合成鼠李糖基化合物的缺點是步驟繁瑣導致得率較低,并且不利于人類健康和環(huán)境保護。而酶法合成鼠李糖基化合物的優(yōu)勢是不但具有嚴格的立體選擇性和一定的區(qū)域選擇性,而且反應條件溫和、對環(huán)境無害。
5、本實驗室前期從Alternaria sp.L1中分離純化了一種α-L-鼠李糖苷酶RhaL1,并且克隆了該酶基因。本論文利用該酶具有催化糖苷合成的能力,以鼠李糖為供體,兩種臨床抗腫瘤藥物羥基脲和5-氟-2'-脫氧脲核苷為受體,通過逆水解反應催化合成了抗腫瘤藥物的鼠李糖苷化合物。合成產(chǎn)物通過凝膠過濾層和高效液相色譜進行分離、純化,質(zhì)譜鑒定了羥基脲鼠李糖苷和5-氟-2'-脫氧脲核苷鼠李糖苷的分子量,核磁共振解析了產(chǎn)物5-氟-2'-脫氧脲核苷鼠
6、李糖苷結構為3'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脫氧脲苷和5'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脫氧脲苷。但是該原始酶催化抗腫瘤藥物鼠李糖苷的產(chǎn)量比較低,我們計劃對其進行分子改造以提高其催化效率。
本論文將Alternaria sp.L1的RhaL1與已知晶體結構、來源于Streptomycesavermitilis的α-L-鼠李糖苷酶(SaRha78A,蛋白晶體編號3w5n)進行序列比對及結構分析,預測出該酶的酸堿
7、催化位點分別為Asp257和Glu530。同時對結合有鼠李糖分子的RhaL1的三維結構進行模擬,經(jīng)過與SaRha78A比對,推測RhaL1的Asp252、Asp257、Asp264、 Trp369、Glu530、His553和Tyr302都能和鼠李糖分子形成直接或間接的氫鍵, Trp369、Trp261、Tyr316、和Pro366參與催化活性中心的疏水口袋的組成。根據(jù)鼠李糖苷酶的催化機制,我們推測這些氫鍵在穩(wěn)定底物(供體)及催化(糖苷
8、)合成反應方面有重要作用,而酶活性中心疏水腔的結構也與底物分子的穩(wěn)定性有關,根據(jù)距離供體分子的距離判斷可能與其發(fā)生相互作用的氨基酸還有Arg548和Trp555。采用Easy Mutagenesis System對上述氨基酸位點進行定點突變,獲得以下單點突變的突變酶:D252N、D252A、D257N、W261A、W261Y、D264N、D264A, Y302F, Y316F, W369A, W369Y, E530D, E530Q, R
9、548A, H553A,W555A,并通過畢赤酵母表達重組突變酶。其中突變酶D252N、D252A、D257N、W261A、D264N、D264A、W369A、E530D、E530Q同時喪失了水解活性和逆水解活性,突變酶W261Y、Y302F、Y316F、R548A、W555A保留了水解活性和逆水解活性,突變酶W369Y、H553A只保留了逆水解活性。對保留了逆水解活性的突變酶W261Y、Y302F、Y316F、W369Y、R548A、
10、H553A、W555A以甘露醇為受體進行了鼠李糖苷合成反應研究,對其逆水解產(chǎn)物進行TLC和HPLC分析結果顯示突變酶Y316F、R548A與原始酶相比,糖苷合成產(chǎn)率均有所提高,其中突變酶Y316F催化糖苷合成的產(chǎn)率最高,比原始酶提高了57%。通過對RhaL1單點突變結果的分析了解到靠近供體分子異頭碳的氨基酸突變之后,酶會同時喪失水解活性和逆水解活性,而那些遠離異頭碳特別是構成疏水口袋的氨基酸突變之后,酶的水解活性和逆水解活性大多數(shù)情況下
11、不會喪失。因此為了提高酶的逆水解活性,應該將酶的改造重點集中在遠離異頭碳且對穩(wěn)定底物分子有重要作用的氨基酸上。
構建pPIC9K/Y316F重組質(zhì)粒,在畢赤酵母KM71中高效表達突變酶Y316F,SDS-PAGE顯示重組蛋白的單亞基分子量為~120kDa,與預測分子量一致;突變酶Y316F對人工底物pNPR的Km值為0.52mM,Vmax為0.89nM/min,與原始酶相比對人工底物pNPR的親和力更強。突變酶Y316F的最適
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