生技劉治敏畢業(yè)論文

1、1重組重組木聚糖酶木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)研究的酶學(xué)性質(zhì)研究姓名姓名:劉治敏劉治敏專業(yè)專業(yè):生物技術(shù)生物技術(shù)指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師:李俊俊李俊俊摘要摘要：本文主要介紹重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學(xué)性質(zhì)以及應(yīng)用。結(jié)果表明：該木聚糖酶XynAHJ3的最適反應(yīng)溫度為70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；60℃下XynAHJ3的半衰期60min，70℃下很快失活；酶反應(yīng)最適反應(yīng)pH為6.0，在pH12.0時(shí)仍具有25%以上的

2、酶活；經(jīng)pH4.0–11.0的緩沖液處理1h，酶活剩余90%以上；10mM的Ag和Hg2可完全抑制XynAHJ3；Fe3、Cu2、Mn2、Pb2及10%（vv）乙醇對XynAHJ3的抑制較強(qiáng)；Zn2、Co2及Fe2對XynAHJ3的抑制較弱（剩余酶活60%）；βmercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高~0.3倍；其余金屬離子和化學(xué)試劑對XynAHJ3的影響很小，10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。關(guān)鍵

3、詞關(guān)鍵詞：木聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；酶活前言：言：木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物細(xì)胞中主要的半纖維素成分。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。一個(gè)木聚糖分子的完全酶解需要幾步酶促反應(yīng)，其中作用于主鏈的酶有兩種：β1，4木聚糖酶和β木糖苷酶。一般而言，前者從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，將木聚糖分解成低聚木糖，而后者則作用于低聚木糖的末端，釋放出木糖[1]。對木聚糖酶的研究早在60年代就已開始，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類

4、型不同性質(zhì)的木聚糖酶[2]。木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)決定了其在應(yīng)用上的潛力及應(yīng)用領(lǐng)域，一般要求木聚糖酶有較高的催化效率、較好的抗逆性、較廣的pH和溫度適應(yīng)范圍等。近年來，大量有關(guān)木聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究不斷展開一方面加深了對木聚糖酶作用的分子機(jī)理的了解另一方面為通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì)、研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的木聚糖酶產(chǎn)品提供了指導(dǎo)?，F(xiàn)在已知能夠產(chǎn)生木聚糖酶的菌種包括細(xì)菌、真菌、黑曲酶、木霉等，不同來源的木聚糖酶的催化特

5、性是有差異的有不同的最適pH和最適作用溫度，金屬離子對不同來源的木聚糖酶活性的影響各不相同[345]。從產(chǎn)木聚糖酶的菌種的篩選，目的基因的提取以及轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶的提純，最后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測定，其一序列的流程目的是為了獲得木聚糖酶的高產(chǎn)菌株，有望應(yīng)用于食品及飼料等產(chǎn)業(yè)，為更好的服務(wù)社會。對實(shí)驗(yàn)室木聚糖酶XynAHJ3整個(gè)獲取流程有一定的了解，本文重點(diǎn)是對其3(6)振蕩器(7)pH儀(8)分光光度計(jì)(9)移液槍，

6、錐形瓶，容量瓶，試管若干2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.12.1重組木聚糖酶組木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3酶活力測定酶活力測定木聚糖酶在一定條件（pH7.0，37℃)下，催化水解底物木聚糖生成木糖等還原糖，還原糖又同DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定其吸光度，計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：在37℃pH7.0條件下，每mL待測酶液每min催化底物生成1μmol木糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。(1)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取l0mm

7、ol／ml木糖標(biāo)準(zhǔn)液0、25、50、100、150、200μl，放于六只帶塞的磨口試管中，用pH7.0檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液補(bǔ)充至1.0ml入DNS試劑1.5ml，于100℃沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出后立即放入冷水浴中冷卻至室溫，冷卻后于分光光度計(jì)上測得OD540以空白管做對照調(diào)零。以O(shè)D540數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的木糖含量(μmol)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。(2)木聚糖酶活力測定的具體方法酶活性測定方法采用DNS法[7]：將底物

8、溶于0.1M緩沖液中，使其終濃度為0.5%（wv）；反應(yīng)體系含100μL適量酶液，900μL底物；底物在37℃預(yù)熱5min后，加入酶液后準(zhǔn)確反應(yīng)10min，然后加1.5mLDNS終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長下測定OD值。空白組先加1.5mLDNS終止反應(yīng)，再補(bǔ)加100μL酶液，其他步驟條件與實(shí)驗(yàn)完全一樣。1個(gè)酶活單位（U）定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量。2.22.2重組木聚糖酶重

9、組木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3的最適的最適pHpH和pHpH穩(wěn)定性的測定方法穩(wěn)定性的測定方法（1）酶的最適pH測定：分別用不同pH的緩沖液配制底物，用實(shí)驗(yàn)室純化的木聚糖酶XynAHJ3在37℃和pH4.0–12.0的緩沖液下進(jìn)行酶促反應(yīng)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活。（2）酶的pH穩(wěn)定性測定：將純化的酶液加入pH3.0–12.0的0.1M緩沖液中，混勻后，在37℃下處理1h，然后在37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為：