冷凍切片方法及注意事項

1、一、實驗前準(zhǔn)備清理實驗臺及儀器。開啟冷凍切片機(jī)并將冷凍切片機(jī)預(yù)降至所需溫度（15~20℃）。準(zhǔn)備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品。二、取材解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或濾紙擦干后不需固定直接取材（24242mm）以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位。（注：取材中目的標(biāo)本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應(yīng)避免不必要的脂肪及壞死組織附著要盡量剔除毛發(fā)、硬骨或鈣化物保乳手術(shù)切緣由于脂肪組織較多取材厚度最好不

2、要超過3mm，厚者冰凍費(fèi)時，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。）三、冷凍切片1、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（1~3分種）。2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。3、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10μm

3、間。4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時，以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織在干凈的玻片上黏附時順著一個方向稍微用力輕輕一帶可避免組織攤片過程中皺折保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。注：①包埋劑的選用：包埋劑是對冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用

4、于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織普通膠水或OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點。）②組織塊過小：先將少量膠擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍約30秒鐘左右待膠凝固時將小組織放上組織周圍再加一些膠再次置于冷凍機(jī)中冷凍這樣組織被墊高就能快速切出高質(zhì)量的切片。③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據(jù)不同的組織而定。溫度過低會導(dǎo)致組織塊過硬切片碎裂出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞反

5、之溫度過高組織塊硬度不夠切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考。④當(dāng)切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。⑤用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當(dāng)附貼切片時，從室溫中取出④分化(1%酸乙醇分化)。⑤于堿水(氨水)中返藍(lán)20秒。⑥伊紅染色10－20秒。⑦脫水，透明，中性樹膠封固。注：固定

6、液的選擇A中性福爾馬林溶液B95%乙醇CAF(40%福爾馬林10ml95%乙醇90ml)DCarnoy(純乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml)EClzrke改良液[4](純乙醇95ml冰醋酸5ml)FBouin液(飽和苦味酸水溶液75ml甲醛水溶液25ml冰醋酸5ml)6種固定液固定后的組織切片染色效果各有差異其中C固定液固定的切片染色效果最好組織結(jié)構(gòu)清晰核染色鮮艷核無明顯腫脹核漿對比度好鏡下與石蠟切片相似(圖1)。D液、E液、F液

7、染色效果均較好結(jié)構(gòu)較清晰核染色較鮮艷但核有腫脹核輪廓有些模糊。A液染色效果較差組織結(jié)構(gòu)尚清楚但細(xì)胞核腫脹比較明顯且境界模糊不清(圖2)。B液染色效果差核著色不良結(jié)構(gòu)模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸對組織均有固定作用。甲醛對組織的穿透力強(qiáng)對組織無明顯收縮和膨脹作用但它不能抵消因冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹所以甲醛固定的組織結(jié)構(gòu)尚完好核有腫脹、模糊。乙醇對組織有脫水收縮作用并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白但后者所產(chǎn)生沉淀可溶解于水使核著色不良

8、。冰醋酸對組織有明顯的膨脹作用加重了冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D液、E液、F液)固定的組織核腫脹明顯。F液中雖然苦味酸對組織有明顯的收縮作用但有冰醋酸的存在仍然防止不了細(xì)胞的腫脹。本實驗提示混合固定液對冷凍切片HE染色的效果優(yōu)于單純固定液但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此推薦冷凍切片做HE染色時首選AF固定液。同時其具有配制簡單、使用方便的優(yōu)點。六、實驗后打掃冷凍切片機(jī)使用結(jié)束后關(guān)閉電源清潔腔體和擦干