實(shí)驗(yàn)五 反相高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中四環(huán)素殘留量

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五反相高效液相色反相高效液相色譜法測定水定水產(chǎn)品中四品中四環(huán)素殘留量素殘留量、、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪康?.了解反相高效液相色譜的組成與分離原理；2.了解高效液相色譜儀的基本操作；3.掌握HPLC定性、定量方法；4.了解水產(chǎn)品樣品的前處理方法。、、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理原理在反相鍵合相色譜法中使用的是非極性鍵合固定相。它是將全多孔(或薄殼)微粒硅膠載體，經(jīng)酸化處理后與含烷基(C8、C18)或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定

2、相。反相色譜的分離機(jī)制有多種，但多傾向于吸附色譜的作用機(jī)制。吸附色譜的作用機(jī)制認(rèn)為，溶質(zhì)在固定相上的保留是疏溶劑作用的結(jié)果(即所謂的疏溶劑理論)。根據(jù)疏溶劑理論，當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動(dòng)相時(shí)，即占據(jù)流動(dòng)相中相應(yīng)的空間而排擠一部分溶劑分子；當(dāng)溶質(zhì)分子被流動(dòng)相推動(dòng)與固定相接觸時(shí)，溶質(zhì)分子的非極性部分(或非極性分子)會(huì)將附著在非極性固定相上的溶劑膜擠開，直接與非極性固定相上的烷基官能團(tuán)相結(jié)合(吸附)形成締合絡(luò)合物，構(gòu)成單分子吸附層，而極性部分暴

3、露在溶劑中。這也就是說溶質(zhì)分子和固定相之間的“結(jié)合”，是由于溶質(zhì)和極性溶劑之間的斥力造成的，而不是非極性溶質(zhì)和非極性固定相之間的微弱的非極性作用力的緣故。這種疏溶劑斥力作用中可逆的，當(dāng)流動(dòng)相極性減弱時(shí)，這種疏溶劑斥力下降，會(huì)發(fā)生解締，并將溶質(zhì)分子釋放而被洗脫下來。所以，流動(dòng)相的極性越強(qiáng)，締合作用就越強(qiáng)。顯然，烷基鍵合固定相對每種溶質(zhì)分子締合作用和解締作用之差，就決定了溶質(zhì)分子在色譜過程中的保留值。稱取5.000g0.001g樣品，置于5

4、0mL離心管中，加入1%高氯酸溶液10mL，用均質(zhì)器均質(zhì)30s，于震蕩器上振蕩提取5min，以4000rmin離心10min。加入1mL正己烷，振蕩1min后，離心5min，除去正己烷相；以微濾膜過濾，濾液備用。4、測定1、開機(jī)按照正確開機(jī)方式，分別開啟工作站、高效液相色譜儀和檢測器，并聯(lián)機(jī)，預(yù)熱；用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)和進(jìn)樣環(huán)，待基線穩(wěn)定。2、建立分析方法先配置系統(tǒng)，empower節(jié)點(diǎn)中選擇系統(tǒng)配置，建新項(xiàng)目和方法。3、進(jìn)樣分析按照濃度有低

5、到高的順序測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下分別分析標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，進(jìn)樣量均為10μL。4、關(guān)機(jī)測定完畢后，用100%甲醇清洗色譜柱和進(jìn)樣環(huán)，按照操作步驟先關(guān)閉電腦后關(guān)高效液相設(shè)備，并清洗所用玻璃儀器。、、結(jié)果處理1、由四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖對土霉素、四環(huán)素進(jìn)行定性分析。2、根據(jù)四環(huán)素的色譜峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。3、有標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和樣品中四環(huán)素的峰面積，計(jì)算濾液中四環(huán)素的濃度。4、樣品中四環(huán)素的含量按下式計(jì)算：mVcX??式中：X—