幾種赤潮微藻的分子鑒定技術(shù)研究.pdf

1、有害赤潮正成為越來越嚴(yán)重的全球性海洋災(zāi)害。赤潮微藻傳統(tǒng)的分類鑒定主要以形態(tài)學(xué)特征為基礎(chǔ)，需借助顯微鏡對(duì)微藻進(jìn)行鑒別，因而具有經(jīng)驗(yàn)豐富的微藻分類學(xué)專家才能勝任，因此不利于對(duì)大樣品量的處理，不能達(dá)到快速檢測的需要。由于不同種屬間基因的多樣性，分子生物學(xué)技術(shù)常被用于赤潮微藻的分類和鑒定。本文以環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（即LAMP技術(shù)）和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為研究手段，對(duì)幾種典型的赤潮微藻的快速檢測和定量鑒定開展了研究。同時(shí)對(duì)目標(biāo)藻引物設(shè)計(jì)、篩選、驗(yàn)

2、證開展了研究，并對(duì)這些引物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證以及初步模擬現(xiàn)場樣品檢測。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.赤潮微藻基因組DNA的快速制備研究。
　　 本研究以塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、環(huán)狀異帽藻（Heterocapsa circularisquama）和角毛藻（Chaetoceros sp.）為研究對(duì)象，采用超聲波法、煮沸法和微波法等3種方法分別對(duì)塔瑪亞歷山大藻（Ale

3、xandriumtamarense）、環(huán)狀異帽藻(Heterocapsa circularisquama)和角毛藻(Chaetoceros sp.)進(jìn)行細(xì)胞破碎及快速制備基因組DNA的研究。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA濃度測定的手段對(duì)三種方法進(jìn)行了比較，以選擇適合不同藻種的細(xì)胞破碎方法。結(jié)果表明，塔瑪亞歷山大藻和環(huán)狀異帽藻用超聲波法破碎效果較好；角毛藻用微波法較好。用該三種方法制備的基因組DNA做了PCR擴(kuò)增，電泳檢測表明，與CTAB法擴(kuò)增效果

4、一樣。本文建立的微藻DNA快速制備方法有望應(yīng)用在赤潮藻類的快速分子鑒定方面。
　　 2.環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測幾種典型赤潮微藻的研究
　　 本研究以鏈狀亞歷山大藻(A. catenella)、微小亞歷山大藻(A. minutum)、短凱倫藻(K. brevis)和微小原甲藻(P. minimum)為研究對(duì)象，首先獲得了四種目標(biāo)藻的ITS序列，然后對(duì)得到的序列和相近屬種的其他微藻進(jìn)行比對(duì)分析，選取合適的基因片段設(shè)計(jì)引

5、物，通過篩選，獲得最佳引物。每種都以其他8種藻作為陰性對(duì)照進(jìn)行LAMP檢測和以外引物F3/B3進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和測序，以驗(yàn)證目標(biāo)藻的引物特異性。同時(shí)，對(duì)目標(biāo)藻的基因組DNA進(jìn)行一系列10倍稀釋，進(jìn)行了敏感度檢測并與常規(guī)PCR做了對(duì)比，得出鏈狀亞歷山大藻、微小亞歷山大藻、短凱倫藻和微小原甲藻的最低檢測限度依次為5.6pg、4.5pg、50pg、3.6pg，敏感度比常規(guī)PCR高10-100倍。該方法引入肉眼檢測的方法，陽性反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)白色混

6、濁，與SYBR Green I反應(yīng)呈現(xiàn)綠色，該檢測方法簡便且省去了膠電泳的過程。本研究所建立的LAMP技術(shù)特異性好，靈敏度高，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，檢測速度快，整個(gè)過程在恒溫65℃條件下，核苷酸的擴(kuò)增和檢測在1個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成，有利于處理大量的樣本；不僅可以對(duì)高濃度時(shí)的微藻樣品進(jìn)行快速檢測，也可以對(duì)低濃度樣品進(jìn)行檢測。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定和定量檢測環(huán)狀異帽藻和微小原甲藻
　　 首先獲得了環(huán)狀異帽藻和微小原

7、甲藻的ITS序列，然后對(duì)得到的序列和相近屬種的其他微藻進(jìn)行比對(duì)分析，使用Primer Express3.0軟件，以目標(biāo)藻的ITS1區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過篩選，獲得最佳引物，并對(duì)引物進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，以其他相近屬種的9赤潮微藻為陰性對(duì)照，以驗(yàn)證目標(biāo)藻種的引物特異性。同時(shí)，以超聲波破碎藻液為模板，進(jìn)行一系列10倍稀釋，進(jìn)行敏感度檢測，環(huán)狀異帽藻和微小原甲藻的最低檢測限度分別為0.5個(gè)細(xì)胞和0.1個(gè)細(xì)胞。初步模擬現(xiàn)場樣品檢測，以含目標(biāo)

8、藻超聲波破碎藻液與其他藻液的混合物為陽性對(duì)照的模板，不含目標(biāo)藻的藻液混合物為陰性對(duì)照的模板，得出其他藻的藻液對(duì)目標(biāo)藻的Real-time PCR擴(kuò)增沒有影響。本研究Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)品采用超聲波破碎所得到的破碎藻液，以該標(biāo)準(zhǔn)品所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，環(huán)狀異帽藻的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.603x+32.598，相關(guān)系數(shù)為R2=0.989；微小原甲藻的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為V=-3.277x+43.708，相關(guān)系數(shù)R2=0.993。以上述超