不同碳源條件下功能菌共代謝降解典型PPCPs的效能與機理.pdf

1、藥品及個人護理用品(pharmaceuticals and personal care products，PPCPs)是一類新興痕量有機污染物，在人類的日常生活中被頻繁使用并通過污水排放、地表徑流等途徑進入自然環(huán)境，于土壤、地下水和地表水中均有檢出。PPCPs通過食物鏈富集后可能對人類健康產(chǎn)生潛在影響，因此為廣大研究者所重視，并采取各種手段對環(huán)境中的PPCPs進行處理。已有研究表明，共代謝是難降解有機污染物的重要去除途徑之一，此方法在P

2、PCPs的處理中同樣有效，然而共代謝的作用基礎(chǔ)是以外加碳源作為生長基質(zhì)給微生物提供能量來源后，微生物再進一步降解以非生長基質(zhì)形式存在的有機污染物，因此外加碳源對共代謝過程十分重要。本研究的目的就在于討論宏觀和微觀程度上不同的碳源對典型PPCPs共代謝過程中功能菌的影響。本研究選取碘普羅胺(iopromide，IOP)、碘美普爾(iomeprol，IOM)和苯扎貝特（bezafibrate，BZF）三種藥品作為典型PPCPs，利用課題組前

3、期分離得到的可分別高效降解IOP和BZF的功能菌PseudomonasSP.I-24（I-24）和Pseudomonas putida B-31(B-31)進行研究，分析了不同碳源對共代謝過程中多因素的作用，研究了酶學調(diào)控機制，建立了酶活力表征方法，并以此為基礎(chǔ)，探討降解酶的最佳作用條件及其各項性質(zhì)，同時通過蛋白質(zhì)差異表達的測定明確不同碳源對降解酶誘導(dǎo)過程的影響，并將功能菌和降解酶應(yīng)用于曝氣生物濾池(biological aerated

4、 filter，BAF)中，觀察PPCPs和常規(guī)污染指標的去除情況，對比靜態(tài)實驗效果，驗證本研究的實際應(yīng)用價值。研究結(jié)果如下:
　　(1)探明了外加碳源與目標污染物的共同降解過程以及該過程中功能菌生長和代謝活性的變化趨勢
　　結(jié)合已有的碳源檢測方法，建立了葡萄糖、麥芽糖、淀粉和甘油在本實驗過程中的優(yōu)化濃度測定方法。分析了不同碳源條件下，功能菌I-24對IOP和IOM以及功能菌B-31對BZF的共代謝特性，發(fā)現(xiàn)淀粉和葡萄糖分別

5、為功能菌I-24和B-31的最佳碳源。以淀粉為外加碳源時，功能菌I-24對IOP和IOM的最高降解率分別為92.70％和38.43％;以葡萄糖為外加碳源時，功能菌B-31對BZF的最高降解率為76.98％，然而功能菌I-24和B-31分別在葡萄糖和淀粉條件下生長情況最佳，故表觀生長情況并非影響目標污染物降解率的決定性因素，但仍可作為降解率的指示因子之一。通過對不同碳源下功能菌電子傳遞系統(tǒng)活性(electron transport sys

6、tem activity，ETSA)的研究，得出麥芽糖對功能菌ETSA的促進效果最強，在IOP、IOM和BZF條件下，培養(yǎng)第一日分別為32.12μg/(g·h)、100.92μg/(g·h)和215.54μg/(g·h)，顯著高于無外加碳源的樣品ETSA值，推測功能菌的表面需要先被外加碳源的電子活化后才會易于與目標污染物接觸，因此ETSA可作為外加碳源參與共代謝過程中釋放電子效率高低的表征數(shù)值。
　　(2)建立了便捷而有效的酶提取

7、及活力表征方法
　　建立并優(yōu)化功能菌I-24和B-31所分泌的降解酶活力表征方法，得出超聲破碎運行時間20min，超聲功率150W時，工作3s，休息2s和工作3s，休息1s分別可從功能菌B-31和I-24中提取最高濃度的降解酶。同時明確降解酶屬于胞內(nèi)酶，它們的測定條件為:反應(yīng)時間2h，培養(yǎng)溫度30℃，緩沖液pH=7，IOP降解酶和IOM降解酶濃度80～100mg/L，滅活溫度80℃，BZF降解酶濃度90mg/L，滅活溫度100℃。

8、
　　(3)探討了環(huán)境影響因子對酶促反應(yīng)過程的作用
　　針對從I-24和B-31兩種功能菌中所提取降解酶的性質(zhì)進行了研究和測定，得出IOP降解酶在pH7～8、10～40℃，IOM降解酶在pH6～8、0～60℃，BZF降解酶在pH6～7、10～40℃時具有較好的pH和溫度穩(wěn)定性，IOP降解酶、IOM降解酶和BZF降解酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm分別為136.70μmol/L、91.08μmol/L、41.85μmol/L

9、和0.05μmol/(L·min)、0.04μmol/(L·min)、0.074μmol/(L·min)。雖然IOP、IOM和BZF并非功能菌正常生長的必須因子，卻是與PPCPs相關(guān)的降解酶的誘導(dǎo)因子之一。無外加碳源的條件下，降解酶通過內(nèi)源呼吸保證菌體活性，誘導(dǎo)過程受到強烈抑制而導(dǎo)致其活力較低。不同外加碳源與PPCPs共同誘導(dǎo)的降解酶有活力差異，其中淀粉作為外加碳源時，IOP降解酶和IOM降解酶活力最高，分別為0.182mU和0.143

10、mU，葡萄糖作為外加碳源時，BZF降解酶活力最高，達到0.188mU，但是培養(yǎng)3d后三種降解酶的活力都會逐漸減小，其原因可能包括代謝產(chǎn)物毒性累積和酶的自身老化。無機鹽培養(yǎng)基中淀粉和葡萄糖的最佳投加濃度為1g/L和3g/L，淀粉濃度過高將與目標污染物產(chǎn)生競爭性抑制，減少降解酶的誘導(dǎo)量。雖然在1～3g/L的葡萄糖范圍內(nèi)其競爭性抑制尚未發(fā)生，但不代表更高濃度的葡萄糖不會抑制酶活力。對降解酶進行雙底物條件的活力測定表明反應(yīng)時間2h內(nèi)IOP降解酶

11、、IOM降解酶和BZF降解酶均無法測得酶活力，說明共代謝降解酶具有非專一特性，在反應(yīng)體系中存在兩種底物時，將優(yōu)先降解結(jié)構(gòu)簡單的底物。
　　(4)分析了功能菌I-24蛋白質(zhì)受碳源影響所產(chǎn)生的差異表達
　　碳源對功能菌及降解酶共代謝過程和降解特性的表觀影響已有所研究，但其對功能菌蛋白質(zhì)的影響尚未明確，因此本研究進一步著眼于功能菌I-24蛋白質(zhì)受碳源影響所產(chǎn)生的差異表達，通過對碳源條件分別為IOP、IOP+淀粉和IOP+葡萄糖這三

12、組不同培養(yǎng)基條件下的功能菌蛋白質(zhì)進行雙向電泳測試，發(fā)現(xiàn)在只有IOP的樣品中蛋白質(zhì)等電點在4.5-6.0之間，其他兩種蛋白質(zhì)為4.5-8.5，三組蛋白質(zhì)分子量均位于25kDa和45kDa之間。對淀粉和葡萄糖條件下的蛋白質(zhì)進行差異點分析，得出28個差異點，相對于葡萄糖條件下的蛋白質(zhì)，淀粉條件下的蛋白質(zhì)共有23個點位上調(diào)表達，5個點位下調(diào)表達。MALDI-TOFMS成功鑒定了其中24個點位，經(jīng)過分析得出淀粉通過ATP合成、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和運輸?shù)戎?/p>

13、要生理環(huán)節(jié)提高了降解酶的誘導(dǎo)水平，它對于谷氨酸鹽利用效率高于葡萄糖，由此獲得更為顯著的ATP合成作用，與此同時，在細胞蛋白代謝過程和超氧化物代謝水平上淀粉都有所提升。
　　(5)檢測了功能菌和降解酶在曝氣生物濾池反應(yīng)器中的處理效果
　　本研究采用實驗室設(shè)計的小型BAF裝置，選擇兩種微污染水進行小試研究，將兩種功能菌及其提取的降解酶投加到兩組濾池中，與一組只接種活性污泥的濾池對照，分析比較常規(guī)工況和碳源種類對三組濾池（空白，投

14、加功能菌，投加降解酶）中常規(guī)污染指標和三種PPCPs的處理情況，分析功能菌和降解酶的實際應(yīng)用效能。結(jié)果顯示功能菌和降解酶對CODMn、氨氮、UV254等常規(guī)污染指標的去除無明顯提升作用，但是對于IOP、IOM和BZF則體現(xiàn)出了較好的去除效果和抗負荷性能。降解酶由于存在酶的流失現(xiàn)象，因此其處理效率會產(chǎn)生較大的波動。相對于復(fù)雜的自然水體，模擬污水條件下，濾池對各種污染物指標的去除更加有效，水力負荷越低，PPCPs與生物膜及濾料的接觸機會越多

15、;溶解氧在一定范圍內(nèi)逐漸增高可促進PPCPs去除，但若持續(xù)增高，將可能破壞生物膜，影響去除效果;碳源種類同樣影響濾池運行狀況，且最佳碳源與靜態(tài)實驗一致，表明在復(fù)雜的環(huán)境中，功能菌和降解酶同樣。IOP和IOM的最佳處理條件為:水力負荷0.08m3/m2·h，DO9.5mg/L，碳源淀粉，BZF最佳處理條件為:水力負荷0.08m3/m2·h，DO7.5mg/L，碳源葡萄糖，三組濾池的PPCPs平均去除率分別為IOP:97.21％、98.12

16、％和98.68％，IOM:97.15％、96.53％和98.50％，BZF:90.04％、90.26％和93.08％。自然水體下，三組濾池的常規(guī)污染指標和PPCPs的去除率均低于模擬污水，但是向其投加碳源后，各項PPCPs去除率均得到提升，接近模擬污水的去除水平。由于曝氣生物濾池反沖洗會影響裝置運行效果，因此對反沖洗方式進行了選擇，其最適運行方式如下:以模擬污水作為來源時，反沖洗周期為10d，運行方式為氣沖，時間1min，強度9～12L