白血病淋巴瘤免疫分型

1、1,白血病/淋巴瘤免疫分型蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所衛(wèi)生部 血栓與止血重點實驗室朱明清2010年8 月 杭州,2,流式細(xì)胞術(shù)的基本概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量,3,散

2、射光信號和熒光信號,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）入射激光的前向散射光信號細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）入射激光90?角的散射光信號細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性熒光素與特異抗體結(jié)合，熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強。,4,CD45/SS示意圖,5,實驗對照的設(shè)計,空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設(shè)同型

3、抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時,6,空白對照和陰性對照的比較：,7,,需要用多少的標(biāo)志來確證感興趣的細(xì)胞群?它們在細(xì)胞上的分布是不是很近?它們是否在不同的細(xì)胞上表達(dá)不同?他們表達(dá)強還是弱?,抗原表達(dá),,,,,CD3,CD4,8,抗原分布,表面,胞漿,核內(nèi)是共同檢測還是分別檢測?,CD3,4,8, tetramer+Cytokines,CD3,4,8, tetramer+

4、DNA,Cytokines+DNA,CD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNA,,9,設(shè)門,08-03307,10,設(shè)門,全部 細(xì)胞,門內(nèi)細(xì)胞,08-03307,11,12,13,血液腫瘤分類進(jìn)程,14,目前最完善的血液腫瘤免疫分型文獻(xiàn),15,白血病免疫分型的理論基礎(chǔ),白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原標(biāo)志是表達(dá)于正常造血細(xì)胞不同分化發(fā)育階段的分化抗原。雖然是惡性腫瘤細(xì)胞，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，

5、因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白血病/淋巴瘤進(jìn)行免疫分型。為了正確分析白血病/淋巴瘤細(xì)胞，必須對正常造血細(xì)胞分化抗原的表達(dá)模式有充分的了解。只有熟悉正常細(xì)胞的抗原表達(dá)模式，才能辨認(rèn)白血病/淋巴瘤細(xì)胞的存在。,16,細(xì)胞類型鑒定,,,Borowitz et al (1993) AJCP 100:534-40.Steltzer et al (1993) Ann NY Acad Sci 667:265-280,17,CD45/SS示意圖,正常

6、骨髓細(xì)胞 血液腫瘤細(xì)胞老化粒細(xì)胞 、噬酸細(xì)胞 早幼—成熟粒細(xì)胞 M3、CML單核細(xì)胞 M4、M5 LGL淋巴細(xì)胞

7、 CLL、ALL、CLD正常前體細(xì)胞 M0、M1、M2、 嗜堿性粒細(xì)胞 M4、M5、ALL成熟紅細(xì)胞、血小板 M6、M7、MM細(xì)胞碎片 Pre-B-ALL 非

8、血液來源細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,18,B淋巴細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine,19,T淋巴細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine,20,粒細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laborat

9、ory Medicine,21,單核細(xì)胞分化與抗原表達(dá)關(guān)系圖,Wood and Borowitz (2006) Henry’s Laboratory Medicine,22,非腫瘤T淋巴細(xì)胞表型,23,非腫瘤B淋巴細(xì)胞表型,24,非腫瘤粒細(xì)胞、單核細(xì)胞表型,25,非腫瘤粒細(xì)胞、單核細(xì)胞表型,26,白血病免疫分型,根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列相關(guān)抗原，確定其系列來源。如：淋系T/B、粒單系、紅系、巨核系等。根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列分化其相關(guān)

10、抗原進(jìn)一步分型。如：早前B，前B，普通B…,27,EGIL，1998年白血病積分系統(tǒng),分值 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO (cyt)CD22 TCRα/β (cyt)IgM TCRγ/

11、δ1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10

12、 CD650.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64*當(dāng)髓系和一個淋系積分均>2分時，則診斷為急性混合

13、細(xì)胞型白血病。,,,,28,急性白血病的四大免疫類型,單表型急性白血病表達(dá)某一個系列抗原為主的急性白血病雙表型/雙克隆急性白血病未分化型急性白血病,29,初治急白分型,Acute Leukemia – Blasts Present >20%,紅系和巨核系的鑒定需要另外增加二線抗體。如:CD71、GPA、CD41、CD61,30,AML-M1,31,,AML-M1,32,AML-M2,33,AML-M2,34,AML-M3

14、,35,AML-M4,36,AML-M4,37,AML-M5,38,AML-M6,39,初治急淋分型,CommonThymocyte,MatureThymocyte,CD2+CD5+Dual CD4+/CD8+sCD3-,CD2+CD5+CD4+ or CD8+sCD3+,CD2-/+CD5-/+sCD3-CD4-CD8-,TdT+CD10-clg-sig-,Pre-B,CD10+cig+TdT+si

15、g-,B,sig+CD10+/-clg+/-TdT-,Common,TdT+CD10+clg-sig-,EarlyThymocyte,Early B-Precursor,40,B細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD19 CD20 HLA-DR CD10 CyIg SmIg FAB分型早前B-ALL + — + — —

16、 — L1,L2 前 B-ALL + —/+ + + + — L1普通B-ALL + +/ — + + — — L1,L2成熟B-ALL + + + +/ — —/+ + L3,,,,41,B-

17、ALL,42,Pre-BALL,43,Common-B-ALL,44,,T細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD7 CD1a CD2 TdT FAB分型早前T-ALL + — — + L1,L2胸腺皮質(zhì)T-ALL + + + + L1,L2

18、 T-ALL + — + + L1,L2,,,,45,T-ALL,46,T-ALL,47,HAL（T/M雙克?。?48,49,,白血病免疫分型的價值,確定ALL的細(xì)胞類型（B細(xì)胞或T細(xì)胞）和 ALL的分化階段。鑒定AML的特征。對形態(tài)學(xué)上未分化的急性白血病有助于鑒定細(xì)胞類型。診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。,50,,診斷雙表型/混

19、合細(xì)胞型急性白血病。鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達(dá)（My+）或AML伴有淋系抗原表達(dá)（Ly+）。鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關(guān)的亞型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,51,淋巴瘤免疫分型,非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)是淋巴系統(tǒng)的一類具有組織和生物學(xué)異質(zhì)性的惡性克隆性疾病。世界

20、衛(wèi)生組織（WHO）結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫表型、基因分型、正常細(xì)胞組成及臨床行為，，新修訂了歐美淋巴瘤分類系統(tǒng)（REAL分類）對淋巴系統(tǒng)腫瘤的分類。這種分類方法在觀察者的組內(nèi)及組間的重復(fù)率為85-95%。WHO淋巴瘤分類是建立在疾病病理形態(tài)、免疫表型、遺傳學(xué)特征、臨床特點的綜合資料基礎(chǔ)上：病理形態(tài)是分類的基礎(chǔ)，大多數(shù)淋巴瘤僅靠病理形態(tài)就能做出明確診斷；免疫表型和遺傳學(xué)特征是確定每一淋巴瘤的重要指標(biāo)，是達(dá)成共識的客觀依據(jù)，有助于提高診斷的可重復(fù)性

21、，具有鑒別診斷和預(yù)后判斷的輔助作用，但在淋巴瘤診斷中并非必不可少；臨床特點，特別是腫瘤原發(fā)部位，如節(jié)內(nèi)或節(jié)外（皮膚、中樞神經(jīng)、胃腸、縱膈、鼻腔），是確定某些淋巴瘤的重要指標(biāo)。雖然定義淋巴瘤是綜合考慮的結(jié)果，但在具體確定一種淋巴瘤時其側(cè)重點有所不同。,52,淋巴瘤病理分類的演進(jìn)形態(tài)學(xué)（Kiel分期）形態(tài)學(xué)加臨床特點(IWF) 形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳特點和臨床特點(REAL WHO分類）,,,,53,WHO認(rèn)為，

22、淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤為同一種疾?。簜鹘y(tǒng)上淋巴瘤和白血病是兩種不同的疾病，現(xiàn)在從形態(tài)、免疫和遺傳學(xué)來看，淋巴瘤和白血病是同一疾病的不同時相（瘤體期或彌散期/循環(huán)期），將它們分開純粹是人為的。淋巴瘤的臨床行為決定了臨床工作中的治療策略，WHO分類系統(tǒng)更多的采用與生物學(xué)特點相關(guān)的淋巴瘤診斷和分類方法，基于淋巴瘤的免疫和分子生物學(xué)特點的治療方法也不斷涌現(xiàn)，這些在將來會大大提高針對淋巴瘤的不同特點進(jìn)行的治療。,54,淋巴瘤免疫分型意義,淋巴瘤

23、免疫分型可以區(qū)分反應(yīng)性與瘤性細(xì)胞：活檢、細(xì)針穿刺與體液標(biāo)本均可；確定腫瘤細(xì)胞的系列：T、B、組織細(xì)胞、髓系、非造血系。分類中根據(jù)免疫表型和DNA含量，可確定低、中、高度惡性程度。區(qū)別不同類型腫瘤細(xì)胞：伯基特細(xì)胞，淋巴母細(xì)胞，濾泡型細(xì)胞（小細(xì)胞混合和/或大細(xì)胞），小淋巴細(xì)胞，套細(xì)胞，彌散小細(xì)胞或大細(xì)胞，免疫母細(xì)胞。確定淋巴瘤的分期：檢測有否血液、骨髓和體液的累及。疾病監(jiān)測：微小殘留病的監(jiān)測，判斷療效（血液、骨髓、細(xì)針穿刺標(biāo)本），確定瘤細(xì)胞

24、表型變化，監(jiān)測Retuximab(抗CD20)治療前后的CD20定量變化，自體干細(xì)胞移植中干細(xì)胞收獲時的瘤細(xì)胞檢測等等.,55,淋系腫瘤WHO分類,56,淋巴瘤診斷的必查項目,根據(jù)淋巴結(jié)或骨髓活檢進(jìn)行診斷,至少需要對一個腫瘤組織的石蠟塊的所有切片進(jìn)行血液病理學(xué)檢查.如果認(rèn)為樣本組織不能確診,則需要重新活檢。腫塊細(xì)針穿刺（FNA）不宜作為淋巴瘤初始診斷的依據(jù)。但是在某些情況下，F(xiàn)NA結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)檢查也可以為診斷提供足夠的信

25、息，特別是在診斷CLL時。某些情況下還需要進(jìn)行免疫組化、分子/細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。,57,流式細(xì)胞術(shù)檢測到的成熟淋巴細(xì)胞常見異常表型,淋巴細(xì)胞某一亞群的擴增 異?？乖磉_(dá)——高/低/缺失/異常共表達(dá) 細(xì)胞形態(tài)增大,58,,,淋巴細(xì)胞,正常淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞增殖性疾病（克隆擴增）,59,B 細(xì)胞可隆性的確定是通過檢測證實所以B細(xì)胞僅表達(dá)一種輕鏈或重鏈:Light chains: “kappa” or “l(fā)ambda”Hea

26、vy chains: IgG, IgA, IgM,60,B細(xì)胞的不同克隆性表達(dá),Normal: k 50; λ 39,k 2; λ 98 +,k 3; λ 93 +,k 86 ?; λ <1,k 1; λ 99,k 5; λ 84 +?,k 99+; λ 1,K99+?;λ 1,61,慢性淋巴細(xì)胞增殖性疾病 （Chronic Lymphoproliferative Disease）,CLL來源于B細(xì)胞，具有免疫球蛋白重鏈或輕鏈

27、基因重排，CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19、CD20、CD23、CD79a與CD5共表達(dá)。而CD38,ZAP-70,Ki67等抗原的表達(dá)與CLL預(yù)后有密切關(guān)系。CLL與其它某些淋巴瘤在形態(tài)學(xué)上相似，但在免疫表型上卻各有特點。,62,慢淋和B淋巴瘤分類,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,CD5-,CD10-,CD10+,Follicula

28、r Cell Or Burkitt’s Lymphoma,SLVL or Marginal Zone LymphomaorHairy Cell Leukemia,CD5+,B-CLLorMantle Cell Lymphoma,MCL：t(11;14)；NCCN要求對所有CLL患者檢測t(11;14)或CCND1表達(dá),63,ALL/CLL?,64,評估CLD的抗體,First: CD5,CD19,kappa,lam

29、da 　　CD3,CD20,CD23,CD10,CD45B-cell:CD22,FMC7,CD11c,CD103 CD38,CD25,CD79b,heavychain (約12-15Ab)T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56 CD16, TCRα/β，TCRγ/δ特殊用途: CD30,bcl-2,TdT　

30、 　CD1a,CD34,CD71Total:約12-16個Ａb,65,B-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen B-CLL HCL Mantle Cell Lymphoma SLVL Follocular LymphomaSIg +/- + ++ ++ ++CD5

31、 ++ — ++ — —CD19 ++ ++ ++ ++ ++CD20 + — ++ ++

32、 ++CD22 +/- ++ ++ ++ ++CD23 ++ — — — —CD79b +/- ++ ++

33、 ++ ++FMC-7 — — ++ ++ ++CD10 — — — — ++CD103 — ++

34、 — — —CD25 + ++ — _ +/- —CD11c +/- ++ — +/- —Antige

35、n：抗原；SIg：膜免疫球蛋白；B-CLL：B慢淋；HCL：毛細(xì)胞型白血?。籑antle Cell Lymphoma：套狀淋巴瘤：SLVL：絨毛樣脾淋巴瘤：Follocular Lymphoma：濾泡型淋巴瘤,,,,66,濾泡中心B細(xì)胞,淋巴瘤,增殖,67,慢性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-CLL）積分系統(tǒng),B-CLL：3-5分；非B-CLL：0-2分,68,ALL/CLL？------MZL,69,CLL,70,CLL,71,MCL,72,H

36、CL,,,,73,HCL,74,FL,75,FL,76,DLBCL,77,DLBCL,78,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,NK LGL,CD2+CD3+,T-Cell Lineage,CD38+CD2-, CD19-,Plasma CellLeukemia/ Myeloma,B-Cell Lineage,CD19+Clonal Ig,CD16+ and/or CD56+CD2+, CD3-,CD

37、4+,T-Cell CLLT-Cell LymphomaT-PLL,ATLL(Adult T-CellLeukemia),T-Cell LGLL,CD8+,CD7-,Sezary Syndrome,慢淋和T淋巴瘤分類,79,T-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen T-CLL ATLL T-PLL T-LGL (CD3+) NK-LGL(CD3-)TdT

38、 — — — — —CD1 — — — — —CD2 ++ ++ ++ +

39、+ ++CD3 ++ ++ ++ ++ —CD5 ++ ++ ++ ++ —CD7 +/- +/-

40、 ++s ++ ++CD16 — — — +/- ++CD56 — — — +/- ++

41、CD57 — — — ++ +CD4+CD8+ — — +/- +/- — CD4-CD8+ — — +/-

42、 ++ +/-CD4+CD8- ++ ++ + — —CD25 +/- ++s +/- +/- NRHLADR +/-

43、+/- — + +,,,,80,81,T-PLL,,,,,,,82,T-PLL,,,,,,,83,,,T細(xì)胞克?。═CR Vβ分析）,84,,,單克隆T細(xì)胞,85,86,87,,88,NK- 淋巴瘤,89,NK-淋巴瘤免疫表型,,90,NK-淋巴瘤/白血病,91,γδT-NHL,92,DI=1.7,,LGL,

44、93,94,,BL-DNA,DLBCL-DNA,95,多發(fā)性骨髓瘤（MM）,多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞異常增生性疾病。正常漿細(xì)胞為CD38+/CD45dim/-，使用 CD38/CD45雙標(biāo)記檢測外周血和骨髓標(biāo)本，可以準(zhǔn)確劃定漿細(xì)胞群。通常使用CD38和CD45，結(jié)合輕鏈檢查，對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。另外，正常漿細(xì)胞的表面標(biāo)記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞通常為CD19-/CD56+。CD138目前認(rèn)為是漿細(xì)胞最特異的指標(biāo)。

45、這樣，使用流式細(xì)胞儀對外周血或骨髓標(biāo)本進(jìn)行多參數(shù)分析，并計算異常漿細(xì)胞含量，對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評估具有重要意義。,96,MM,97,,,,,,,,,,98,,,,,,,99,100,,,流式免疫分型報告內(nèi)容,101,流式免疫表型診斷血液腫瘤的劣勢,1、纖維化、硬化的骨髓可能沒有足夠的細(xì)胞分析。2、細(xì)胞太多聚集或成團也可能沒有足夠的分析細(xì)胞。3、硬化的組織也很難得到足夠的分析細(xì)胞。4、組織結(jié)構(gòu)關(guān)系、形態(tài)關(guān)系丟失。5、比例