現(xiàn)代生化技術(shù)復(fù)習(xí)要點(diǎn)2015

1、第一章第一章重組重組DNA技術(shù)技術(shù)1.寄主的限制和修飾現(xiàn)象：寄主的限制和修飾現(xiàn)象：細(xì)菌能將外來(lái)的DNA片段某些專(zhuān)一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不為外來(lái)噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做主的限制和修飾現(xiàn)象2.1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ類(lèi)酶特點(diǎn)：類(lèi)酶特點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專(zhuān)一，并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)將DNA鏈切斷2.2Ⅱ類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶命名：類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名一個(gè)字母（大寫(xiě)）種名兩個(gè)字母

2、（小寫(xiě)）株名等發(fā)現(xiàn)順序（羅馬字母）2.3限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性：限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些限制性核酸內(nèi)切酶的切割序列發(fā)生低特異性，這種性質(zhì)稱(chēng)為限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性（限制性?xún)?nèi)切酶在含（限制性?xún)?nèi)切酶在含50%甘油甘油的緩沖液中，于的緩沖液中，于20℃穩(wěn)定保存）穩(wěn)定保存）2.4部分酶切：部分酶切：部分酶切是指，只對(duì)片段上一部分酶切位點(diǎn)產(chǎn)生切割。這種一般是在建庫(kù)，或者需要酶

3、切基因組后，獲得一定大小范圍內(nèi)的片段而使用的酶切方法。這種酶切不要求獲得某一大小的片段，而是要獲得例如200500bp的片段，在電泳上沒(méi)有條帶，而是smear。所以部分酶切需要嚴(yán)格控制酶的用量和時(shí)間，要嘗試稀釋后的酶液，切一定時(shí)間段內(nèi)，哪一個(gè)條件可以獲得目標(biāo)范圍的片段。部分酶切的條件需要更多的摸索，而且重復(fù)性要求也會(huì)更高。2.5同尾酶：同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列2.6同裂酶：同裂酶：來(lái)源不同，識(shí)別序列相同，

4、切割位點(diǎn)可以相同（同序同切酶）也可以不同（同序異切酶），存在位點(diǎn)偏愛(ài)現(xiàn)象。3.1甲基化酶：甲基化酶：許多Ⅱ類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶都相應(yīng)存在著相對(duì)的甲基化酶，它們可修飾限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列中某位堿基甲基化，從而使DNA免受相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶的切割。用途：就是在必要時(shí)可以封閉某一限制性核算內(nèi)切酶的切口。命名：在對(duì)應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶名字前面加M甲基化對(duì)限制性核算內(nèi)切酶的影響：1.修飾酶切位點(diǎn)2.產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)3.23.2T4DNAT4DN

5、A連接酶：連接酶：在實(shí)驗(yàn)中絕大多數(shù)情況下使用的是T4DNA連接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的T4DNA連接酶是由大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)DNADNA連接酶連接酶：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相鄰的3’OH和5’P之間形成的磷酸二酯鍵3.33.3S1S1核酸酶：核酸酶：來(lái)源于米曲霉菌，其特征如下：1.降解單鏈DNARNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度2.降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡

6、核苷酸3.酶切活性需要pH4.04.5的酸性環(huán)境，且為Zn2所激活4.酶量小時(shí)僅切割帶缺口或缺刻的雙鏈DNA5.酶量過(guò)大時(shí)會(huì)降解雙鏈核酸，因?yàn)殡p鏈降解活性比單鏈低7.5萬(wàn)倍S1核酸酶常用來(lái)切平突出的單戀末端3.43.4DNADNA聚合酶聚合酶Ⅰ：5’3’聚合酶活性——聚合作用3’5’外切酶活性——校對(duì)作用5’3’外切酶活性——切除修復(fù)作用（切口平移）KlenowKlenow酶：酶：是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的氨基大片段，沒(méi)有5’3’外切酶

7、活性，基因工程中常用該酶填平5’突出的粘性末端進(jìn)入細(xì)胞后，完全依靠質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選含有多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆8.DNA8.DNA片段的連接片段的連接定向克??；外源DNA片段定向插入載體分子粘性末端：（不同粘性末端的連接）1.突出末端相同（5’突出）：用Klenow酶補(bǔ)平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接2.突出末端相同（3’突出）：用T4DNA聚合酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接。3

8、.突出末端不同：用Klenow酶補(bǔ)平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接平末端：屬于分子內(nèi)的連接，反應(yīng)速度要比粘性末端的連接慢得多添加同聚尾末端方向：用Klenow補(bǔ)平或者用同聚結(jié)尾法都是從5’3’，切5’突出用S1核酸酶，切3’突出用T4DNA聚合酶9.9.提高重組率的方法：提高重組率的方法：（1）提高外源DNA片段與載體的分子比（2）載體分子在連接前先除磷（3）用TdT加裝人工粘性末端10.110.1轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：將質(zhì)粒

9、為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱(chēng)轉(zhuǎn)化子10.210.2重組子：重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞10.310.3轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率：產(chǎn)生菌落的總數(shù)DNA的加入量。定義：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)11.11.感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞處于攝入外源DNA的狀態(tài)12.112.1轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程12.212.2轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：將噬菌體（病毒）DN

10、A導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程12.312.3轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體顆粒為媒介轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程13.113.1抗菌性篩選法（抗菌性篩選法（exex環(huán)絲氨酸篩選）環(huán)絲氨酸篩選）最常見(jiàn)的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素（Ampr）、抗四環(huán)素（Tetr）、抗卡那霉素（kanr）等當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素是，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)消失13.213.