絲狀藍(lán)藻calothrixsp.pcc7601基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用研究

1、摘 要藍(lán)藻 ( C y a n o p h y t e ) 又稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌 ( C y a n o b a c t e r i u m ) ， 在光合作用、固氮、遺傳以 及進(jìn)化等方面表現(xiàn)出 獨(dú)特的 性質(zhì)，長(zhǎng)期以來(lái)受到生物工作者的重視和深入的研究。 特別是近年來(lái)，隨 著基因工程研究的 迅速發(fā)展，很多學(xué)者認(rèn)為藍(lán)藻可能成為表達(dá)外源基因的很好的自 養(yǎng)型受體系統(tǒng)，并已 建立了一些藍(lán)藻的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和外源基因表達(dá)系統(tǒng)。 然而有關(guān)絲狀藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因的研究

2、進(jìn)展緩慢，主要原因是不易構(gòu)建能在絲狀藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定維持的質(zhì)粒載體系統(tǒng)。為使引 入的外源基因能在絲狀藍(lán)藻中穩(wěn)定維持 和表達(dá)， 本 研究構(gòu)建了 絲 狀藍(lán) 藻 C a l o t h r i x s p . P C C 7 6 0 1 的 基因 整合平臺(tái) 系 統(tǒng)， 并 表 達(dá)了 含有 胸 腺素a , ( T h y m o s i n。 ， ， T a , ) 的 融 合蛋白 。 、 丫 根 據(jù) 前 人 對(duì) C a l o t h r

3、 i x s p . P C C 7 6 0 ‘ 基 因 組 部 分 序 列 分 析 結(jié) 果 ， 用 P C R 擴(kuò) 增出藻藍(lán)蛋白 操縱子2 ( c p c 2 ) 中的兩個(gè) 相 鄰片 段作為 基因 整合的同 源序列。然后經(jīng)多步亞克隆，在這兩個(gè)同 源片段之間插入了 包括目 的 基因U b - T a ; 融 合 基因 和報(bào)告 基因 卡 那 霉素 抗 性 基因 ( K m ` ) 的 外 源 供 體D N A片 段， 構(gòu) 建成 基

4、因整 合 平臺(tái) 系 統(tǒng)的 供體 質(zhì) 粒 p U T K 。 為 使 建 立的 基因 整合 平臺(tái) 系統(tǒng) 能 高 效 表 達(dá)， 本 研 究 用 P C R擴(kuò) 增出c p c 2的 完 整 啟 動(dòng)區(qū)作 為 目 的 基 因 表 達(dá) 的 啟 動(dòng) 子 ， 它 是 紅 光 誘 導(dǎo) 的 強(qiáng) 啟 動(dòng) 子 。 為 了 提 高 胸 腺 素 “ ， 的 表 達(dá)量， 還 采 用了 泛素 ( U b i q u i t i n . U B ) 融 合 表達(dá)的

5、辦 法。供體 質(zhì) 粒p U T K電 激 轉(zhuǎn) 化C a l o t h r i x s p . P C C 7 6 0 1 后， 以K m篩選，獲得了若干轉(zhuǎn)化藻株，其對(duì) K m 的抗性皆超過(guò) 4 0 u g / m l ，最高可達(dá)8 0 u g / m l ， 并 在轉(zhuǎn)接若干次 之后仍 基本保持不 變。經(jīng) P C R證實(shí)，目 的 基因U b - T a ， 已 整合在 。l o t h r i x s p . P C C 7

6、6 0 1 染色體上， 可隨 染 色體的 復(fù)制而復(fù)制;經(jīng)W e s t e r n 雜交證實(shí)， 融合蛋白 確有表達(dá)。本 研 究實(shí) 現(xiàn)了 外 源目 的 基 因 通 過(guò) 基因 整 合 平臺(tái) 系 統(tǒng) 在 轉(zhuǎn) 化 藻 株中 的 有 效 表 達(dá) ， 為 開(kāi) 發(fā) 轉(zhuǎn)T a ， 基 因 藍(lán) 藻 打 下 了 基 礎(chǔ)丫 一-關(guān) 鍵 詞: C a l o t h r i x s p . P C C 7 6 0 1 ， 基因 整 合， 胸腺 素。t r

7、a n s f o r m a n t s , w h i c h c a n r e s i s t mo r e t h a n 4 0 u g / ml k a n a m y c i n a n dr e ma i n t h e r e s i s t a n c e a f t e r m o r e t h a n t e n g e n e r a t i o n s . T h e

8、r e s u l t o fP C R i mp l i e d t h a t U b - T a , g e n e l o c a t e o n t h e c h r o m o s o m a l D I V A o fC a l o t h r i x s p . P C C 7 6 0 1 a n d c a n r e p l i c a t e w i t h i t . B

9、 y w e s t e r n b l o ta n a l y s i s , i t w a s c o n f i r me d t h a t t h e f u s i o n p r o t e i n w a s e x p r e s s e d .T h i s r e s e a r c h w o r k r e a l i z e d t h e e x p r e s s i

10、o n o f f o r e i g n g e n e i n C a l o t h r i x s p . P C C 7 6 0 1 b y g e n e i n t e g r a t i o n p l a t f o r m s y s t e m , a n dG i v e s a b a s i s f o r d e v e l o p i n g t r a n s f e