FLP-frt重組系統(tǒng)的構(gòu)建和在轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用.pdf

1、以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的植物基因工程技術(shù)為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持，但是用以有效篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等)的使用卻引發(fā)了人們對轉(zhuǎn)基因植物安全性的隱憂。因此，培育具有安全選擇標(biāo)記基因或無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物成為提高轉(zhuǎn)基因植物安全性的有效手段。其策略之一是在轉(zhuǎn)化植株篩選完成后，采取一系列措施將選擇標(biāo)記基因刪除。來自于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2μm質(zhì)粒的FLP

2、/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個(gè)同向frt位點(diǎn)間DNA片段的切除，利用該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)篩選完成后選擇標(biāo)記基因的刪除。 本工作構(gòu)建出可有效去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)：含有FLP重組酶基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-FLP-hpt和含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-AtNHX1-frt-als-frt和pCAMBIA1300-betA

3、-frt-als-frt。組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控的重組酶FLP基因的表達(dá)可催化位于選擇標(biāo)記基因als兩側(cè)同向frt位點(diǎn)間的重組反應(yīng)從而有效去除選擇標(biāo)記基因als。為了提高該系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的重組效率，在FLP重組酶基因編碼區(qū)前添加了植物最適翻譯修飾序列AACA，在含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體中位于選擇標(biāo)記基因als一側(cè)的是一個(gè)全長的frt位點(diǎn)，而另一側(cè)為僅包含核心重組序列的截短的frt位點(diǎn)。 利用共轉(zhuǎn)化和二次轉(zhuǎn)化的方式

4、將含育frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-AtNHX1-frt-als-frt或pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有FLP重組酶基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-FLP-hpt同時(shí)或先后轉(zhuǎn)入煙草植株驗(yàn)證FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的重組功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用重組酶FLP植物表達(dá)載體二次轉(zhuǎn)化含有frt位點(diǎn)的抗選擇標(biāo)記煙草植株時(shí)，17％的共轉(zhuǎn)化植株發(fā)生了選擇標(biāo)記基因切

5、除事件；利用含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體與重組酶FLP植物表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，二者感染煙草葉盤濃度比為3∶1時(shí)共轉(zhuǎn)化效率最高，為21％，共轉(zhuǎn)化植株選擇標(biāo)記基因的切除效率為5％；而利用含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體二次轉(zhuǎn)化含有重組酶FLP基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株時(shí)，轉(zhuǎn)化效率只有1.6％，且未見到選擇標(biāo)記基因被切除。 利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)FLP重組酶基因在植物發(fā)育的特定時(shí)期高效表達(dá)可防止FLP重組酶基因在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)帶來的基因

6、組不穩(wěn)定等問題。相對于其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子具有誘導(dǎo)簡便、反應(yīng)靈敏、作用高效、對植物生長發(fā)育危害小等優(yōu)點(diǎn)。本工作克隆得到黑豆和黃豆“荷豆2號”熱誘導(dǎo)蛋白啟動(dòng)子hsp1和hsp2，序列分析表明二者均具備高等植物啟動(dòng)子的必需元件和熱誘導(dǎo)元件。對轉(zhuǎn)基因煙草中g(shù)us基因表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖醛酸酶活性的組織化學(xué)染色和熒光定量分析表明，大豆熱誘導(dǎo)蛋白啟動(dòng)子hsp1和hsp2均可經(jīng)間隔12小時(shí)的兩次42℃下2小時(shí)的熱激處理誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，熱