轉(zhuǎn)基因細胞模型的構(gòu)建及其在致癌活性檢測中的應(yīng)用.pdf

1、為了滿足日益增多的化學(xué)物質(zhì)致癌活性檢測的需要，本研究擬建立惡性轉(zhuǎn)化前的非轉(zhuǎn)化人細胞株并探討其致癌活性檢測的可行性，目的在于完善目前所采用的體外代謝系統(tǒng)，建立穩(wěn)定的、操作簡便、靈敏度高的細胞檢測模型。 研究內(nèi)容及方法： 1.細胞模型的構(gòu)建 1.1轉(zhuǎn)基因細胞模型的構(gòu)建 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法于永生化人支氣管上皮細胞16HBE中導(dǎo)入人端粒酶催化亞基hTERT或空白載體，通過端粒重復(fù)序列擴增法檢測端

2、粒酶的活性；用P450-GLOTM檢測CYP1A1酶活性。 1.2DNA修復(fù)基因缺陷細胞的構(gòu)建 利用慢病毒載體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，把4種DNA修復(fù)基因共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因、切除交錯互補修復(fù)基因1、切除交錯互補修復(fù)基因2、錯配修復(fù)基因的短發(fā)夾雙鏈RNA載體導(dǎo)入永生化人胚腎上皮細胞株，并設(shè)立靶向干擾熒光蛋白的shRNA載體作為對照。嘌呤霉素篩選后分別命名HEK-shATM，HEK-shERCC1，HEK-shERC

3、C2，HEK-shMLH1和HEK-shGFP。RT-PCR驗證DNA修復(fù)基因沉默細胞株ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1mRNA的表達。 2.細胞生物學(xué)特性觀察 通過對細胞的形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線、倍增時間、染色體畸變、軟瓊脂克隆形成情況及裸鼠皮下成瘤情況，觀察轉(zhuǎn)基因及修復(fù)基因沉默對細胞生物學(xué)特性的影響。以DNA修復(fù)基因沉默細胞為靶細胞，1.0μg/ml絲裂霉素MMC染毒，觀察DNA修復(fù)基因沉默細胞對MMC遺傳損傷

4、的敏感性。 3.環(huán)氧二醇苯并芘、硫酸鎳、甲硝基亞硝胍、佛波酯誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化試驗 首先用臺盼藍染色法測定細胞毒性，根據(jù)細胞存活率計算半數(shù)致死濃度，選擇LC50的30％作為染毒的最高劑量。BPDE、NiSO4、MNNG作用于16HBE細胞的LC50分別是4.5μM、774μM、15μM。DMSO作為溶劑對照組。以轉(zhuǎn)化細胞HEKTRST作為陽性對照。將細胞消化后按5×104個每孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個平行樣。染毒24

5、小時后棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。每周染毒一次，共4次。于初次染毒后第5周開始，每3周將染毒后的細胞接種到軟瓊脂，將能夠連續(xù)兩周在軟瓊脂中形成克隆的細胞接種到裸鼠皮下驗證其惡性轉(zhuǎn)化表型。觀察各轉(zhuǎn)基因細胞模型及DNA修復(fù)基因沉默細胞模型對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的敏感性。 4.B(a)P的代謝活化及誘導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)化 采用3種方式代謝活化B(a)P：加入S9-mix、過度表達CYP1A1、染毒前用1μM低劑量B(a)P誘導(dǎo)HBETR細胞

6、48小時。計算加入S9-mix或未加入S9-mix下B(a)P作用于HBE細胞的LC50，分別足10μM和80μM。加入S9-mix時B(a)P染毒濃度是0.1μM、0.5μM和1μM，染毒6個小時；HBETR-1A1和HBETR-IN細胞的染毒濃度5μM、10μM和20μM，染毒24小時。細胞消化后按5×104個每孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板，設(shè)3個平行樣，染毒24小時棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。每周染毒一次，共4次。于第5周進行軟瓊脂實驗

7、及裸鼠皮下成瘤試驗，每3周進行一次，觀察3種方式代謝活化B(a)P和誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的能力。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)基因細胞模型及DNA修復(fù)基因缺陷細胞模型的建立 RT-PCR檢出HBET細胞hTERTmRNA表達，蛋白印跡法驗證了HBET細胞HA的表達，端粒酶活性檢測表明HBET細胞中端粒酶活性明顯增高；蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，癌基因H-Ras，c-Myc及猿猴病毒SV40ST的蛋白表達升高；RT-PCR驗證HBETR-1A

8、1細胞CYP1A1mRNA的表達，蛋白印跡結(jié)果表明HBETR-1A1細胞CYP1A1蛋白的表達是對照HBETR-V細胞的2.7倍，酶活性的檢測結(jié)果表明HBETR-1A1細胞CYP1A1酶活性是對照HBETR-V細胞的5.5倍；HBETFRST和HBETMST細胞于熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)約80％細胞表達熒光，表明轉(zhuǎn)基因細胞株HBET、HBETM、HBETR、HBETR-1A1、HBETRST、HBETMST構(gòu)建成功。從RT-PCR的結(jié)果可見，各

9、修復(fù)基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1均有不同程度的抑制，表明幾種修復(fù)基因沉默細胞構(gòu)建成功。 2.細胞的生物學(xué)特性 2.1細胞形態(tài)及生長特性的觀察 hTERT、癌基因H-Ras、c-Myc及CYP1A1的表達未使細胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，但SV40ST的導(dǎo)入使細胞體積增大，細胞失去接觸抑制，呈重疊生長。端粒酶催化亞基hTERT的導(dǎo)入使細胞的增殖速度明顯加快，而癌基因H-Ras、c-Myc和SV40ST

10、的導(dǎo)入進一步加快細胞的增殖速度。 2.2染色體畸變分析 在計數(shù)的100個中期相細胞中，染色體畸變以染色體數(shù)目異常為主，偶見染色單體斷裂的結(jié)構(gòu)異常,差異無顯著性，提示癌基因的導(dǎo)入未引起細胞染色體畸變率明顯的改變。 2.3細胞轉(zhuǎn)化活性檢測 把上述構(gòu)建的幾種細胞接種在軟瓊脂中，觀察細胞形成克隆的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了HBETMST和HBETRST兩株細胞在軟瓊脂中形成大量的克隆，其它幾株細胞HBET、HBETM、H

11、BETR和HBETR-1A1未見克隆生長。將HBETMST和HBETRST兩株細胞接種于裸鼠皮下，接種后13天形成肉眼可見的腫瘤，而其它細胞均不能在裸鼠皮下形成腫瘤。結(jié)果表明細胞在永生化基礎(chǔ)上表達癌基因H-Ras或c-Myc，不足以使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，但是SV40ST的導(dǎo)入最終誘導(dǎo)細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 2.4DNA修復(fù)基因沉默影響 絲裂霉素C誘導(dǎo)的DNA損傷效應(yīng)DNA修復(fù)基因沉默細胞HEK-shATM、HEK-shERCC

12、1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在細胞形態(tài)、生長速度以及染色體畸變率方面沒有差別，細胞均未能在軟瓊脂中形成克隆和在裸鼠皮下成瘤，提示DNA修復(fù)基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1的沉默并沒有影響細胞的生物學(xué)特性。 MMC作用后各細胞株微核率均于染毒后24h達到高峰，與對照相比差異有顯著性；MMC于染毒24小時撤掉后對各細胞株的微核率下降過程的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：對照組在染毒后的60h，微核率基本下降至正常，表明

13、DNA修復(fù)基因ERCC2、ATM的沉默使細胞對化學(xué)物質(zhì)作用的敏感性增高。 3.BPDE、NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)化 3.1HBETR、HBETM、HBETV細胞轉(zhuǎn)化敏感性的比較 HBETR、HBETM、HBETV細胞在軟瓊脂中的克隆形成數(shù)與染毒劑量之間存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系。提示癌基因H-Ras和c-Myc高表達可縮短細胞轉(zhuǎn)化的間期，提高細胞轉(zhuǎn)化效率，H-RasVI2高表達較c-Myc更為敏感。

14、 3.2HBETR和HEKTR細胞轉(zhuǎn)化敏感性的比較 HBETR與HEKTR細胞相比，在BPDE、NiSO4、TPA、MNNG誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化試驗中較HEKTR細胞敏感，轉(zhuǎn)化間期較HEKTR細胞縮短4-6周。雖然兩種細胞對MNNG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的敏感性一樣，但發(fā)現(xiàn)HBETR細胞克隆形成率較HEKTR細胞高。提示致癌物誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化具有靶細胞特異性。 3.3NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因沉默細胞轉(zhuǎn)化試驗

15、DNA修復(fù)基因沉默細胞HEK-shATM、HEK-shERCC1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在NiSO4、MNNG、TPA作用下，觀察20周均未發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。提示幾種DNA修復(fù)基因沉默細胞對NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化不敏感。 4.B(a)P的代謝活化及誘導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)化 采用3種方式代謝活化B(a)P：加入S9-mix、過度表達CYP1A1、染毒前用1μM低劑量B(a)P誘導(dǎo)HBETR細

16、胞48小時(HBETR-IN)。結(jié)果與酶活性及蛋白表達水平相一致。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了癌基因H-RasVI2和癌基因c-Myc高表達的轉(zhuǎn)基因細胞株，所構(gòu)建的細胞株生長速度加快，但生長形態(tài)、染色體畸變、錨著獨立性生長等生物學(xué)特性無明顯改變，未能獲得惡性轉(zhuǎn)化的表型。在高表達H-Ras和c-Myc的基礎(chǔ)上繼續(xù)導(dǎo)入SV40ST能誘導(dǎo)細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了DNA修復(fù)基因ATM、ERCC1、

17、ERCC2、MLH1沉默細胞株，所構(gòu)建的細胞株在生長形態(tài)、生長速度、染色體畸變、錨著獨立性生長等生物學(xué)特性無明顯改變，未能獲得惡性轉(zhuǎn)化的表型。其中ATM和ERCC2基因沉默細胞對絲裂霉素C誘導(dǎo)的DNA損傷作用敏感性增高。DNA修復(fù)基因沉默細胞模型對致癌物誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化不敏感。 3.H-RasVI2和癌基因c-Myc高表達可縮短細胞轉(zhuǎn)化的間期，提高細胞轉(zhuǎn)化效率，H-RasVI2高表達較c-Myc更為敏感。致癌物誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化具有靶