人ae2基因的cdna克隆及真核表達(dá)載體pcdna3.1wtae2的構(gòu)建

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明1 毛‘8S 2 S學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名( 手寫) ：≯浮移 簽字同期：≯∥彥年／月廠3 日學(xué)位論文

2、版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解 南昌大學(xué) 有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者

3、簽名( 手寫) ： 灑輔多t ／簽字同期：紗6 年 么月廠，日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：導(dǎo)師簽名c 手寫，一 簽字日期：例年∥月 ／婦、電話：郵編：摘要摘 要目的：利用分子克隆技術(shù)克隆人野生型全長A E 2 c D N A ，構(gòu)建出p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，并檢測該表達(dá)質(zhì)粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞系H U V E C s A E 2 基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究A E 2 在疾

4、病中的生物學(xué)功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：1 ．用D M E M + 1 0 ％F B S 培養(yǎng)基培養(yǎng)人H e L a 細(xì)胞，從H e L a 細(xì)胞中提取總R N A ；自行設(shè)計(jì)上下游各帶有N h e I 和H i n d I I I 限制性酶切位點(diǎn)的P C R 引物，采用R T - P C R 技術(shù)，將總R N A 反轉(zhuǎn)錄成c D N A ，再擴(kuò)增出A E 2 基因全長c D N A 片段。2 ．用限制性核酸內(nèi)切酶N h eI 和H i n

5、 d l l l 分別雙酶切p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒和A E 2c D N A 片段，電泳分離后回收純化兩端帶不同粘性末端的p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒和A E 2c D N A 片段；用T 4 D N A 連接酶連接p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒和A E 2 片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞T O P I O ，在含有終濃度為5 0 m ∥m l A m p 的L B 固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2 4 h 后，挑取單個(gè)陽

6、性菌落擴(kuò)增，提取并純化重組體質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 - w t - A E 2 。3 ．用三種方案的限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定所構(gòu)建重組載體p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 ，得出肯定結(jié)果后通過D N A 測序進(jìn)一步鑒定。4 ．將綠色熒光蛋白質(zhì)粒p E G F P ．N 2 轉(zhuǎn)染H U V E C s ，觀察2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 及7 2 h 綠色熒光的表達(dá)量，確定轉(zhuǎn)染效率的時(shí)效關(guān)系而推測重

7、組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。5 ．將重組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 一w t ．A E 2 轉(zhuǎn)染H U V E C s ，隨機(jī)分為三個(gè)組：正常對(duì)照( C o n t r 0 1 ) 組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 組、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2組。通過R T - P C R 和W e s t e r nB l o t t i n g

8、檢測H U V E C s 中A E 2 m R N A 和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：1 ．R T - P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在預(yù)期位置顯示了清晰的亮帶，這一結(jié)果提示已成功擴(kuò)增出了特異性的目的基因A E 2 c D N A 。2 ．將分別雙酶切后的p c D N A 3 ．1 質(zhì)粒和A E 2c D N A 片段用T 4 D N A 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞T O P I O ，經(jīng)A m p 篩選，在培養(yǎng)皿上可見陽