含潛在纖維素酶增效蛋白菌種的搜尋、基因克隆、表達(dá)及產(chǎn)物活性檢測.pdf

1、纖維素被認(rèn)為是廣泛存在的可再生資源，預(yù)計未來將取代液體燃料。木質(zhì)纖維素水解的單糖是重要的原料，因為這些混合單糖可用于各種生產(chǎn)過程，包括生產(chǎn)乙醇燃料。然而，纖維素高聚合度結(jié)晶結(jié)構(gòu)具有天然抗性，因此難以進(jìn)行物理或化學(xué)降解。其中，木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素和半纖維素的存在也限制了它的降解。木質(zhì)纖維素的降解過程是多種酶協(xié)同的過程。近年，發(fā)現(xiàn)一種能促進(jìn)纖維素酶活性的蛋白，稱為增效蛋白，其中Expansin家族和Expansin like家族引起許多研究者

2、的關(guān)注。Expansin首先在黃瓜下胚軸中發(fā)現(xiàn)，并具有松弛細(xì)胞壁的功能，自身卻不能水解纖維素。Expansin是一類基因超家族，其編碼約25KDa的蛋白質(zhì)。近年來，在細(xì)菌和真菌中發(fā)現(xiàn)了大量的Expansin like蛋白?？莶菅挎邨U菌是第一種發(fā)現(xiàn)含有Expansin like的微生物，這種增效蛋白與纖維素酶具有協(xié)同作用，能大大提高纖維素酶水解的效率。由于微生物是工業(yè)生產(chǎn)最理想的生物，所以，本研究目的是從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)含有潛在增效蛋白的新菌種

3、。
　　首先，以枯草芽孢桿菌Expansin like序列(gi|2619024|gb|AAB84448.1| YoaJ[Bacillus subtilis])為模版，初步找到大量的Expansin like同源序列，再根據(jù)這些同源序列找到這類蛋白高度保守的motifs，最后以motifs找到含有潛在增效蛋白的新菌種。運用同源建模的方法對新菌種氨基酸序列進(jìn)行建模，與蛋白數(shù)據(jù)庫中的Expansin like蛋白模型進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)比對，

4、確定含有相似的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過整理分析獲得Sterptomyces ipomoeae; Corallococcus coralloides; Saccharothrixsyringae; Cystobacter violaceus; Methylibium sp.CF059; Acidovorax radicis6種含有潛在增效蛋白的菌種。
　　根據(jù)比對結(jié)果從普通微生物保藏中心購買甘薯鏈霉菌菌株，根據(jù)序列特異性設(shè)計引物。提取番薯鏈霉菌總

5、基因組，進(jìn)行PCR擴增，序列長672bp，凝膠回收擴增片段，提取pET-28a(+)和pET-32a(+)質(zhì)粒與回收的目的片段進(jìn)行雙酶切，回收雙酶切片段在T4連接酶的體系下連接，形成重組質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α，平板涂布后挑選單菌落，送去測序。分析測序結(jié)果確定正確重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21和E.coli Rosetta(DE3)，平板涂布挑選單菌落，測序獲得重組表達(dá)菌。
　　增效蛋白在