基于軟磁材料巨磁阻抗效應(yīng)的生物標(biāo)志物檢測方法研究.pdf

1、巨磁阻抗(Giant Magnetoimpedance，GMI)效應(yīng)自從1992年被日本名古屋大學(xué)毛利家雄教授發(fā)現(xiàn)以來，其巨大的應(yīng)用前景很快吸引了全球各國學(xué)者的關(guān)注?；贕MI效應(yīng)的磁傳感器因其高靈敏度、響應(yīng)速度快等獨特的優(yōu)勢很快在磁傳感領(lǐng)域占有了一席之地。而隨著以微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)和大規(guī)模集成電路技術(shù)為代表的高新技術(shù)的發(fā)展，把GMI傳感器推向了微型化、集成化和智能化方向，使得其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更加寬廣。基于GMI效應(yīng)的生物

2、傳感器是以磁性納米粒子或以磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠為標(biāo)簽，利用高靈敏度的GMI磁傳感器來實現(xiàn)對生物分子信息的檢測。基于GMI效應(yīng)的生物傳感器還處在初步階段，需要不斷探索新的應(yīng)用領(lǐng)域。GMI磁傳感器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)是高性能GMI傳感器的制備以及檢測方面，如檢測的穩(wěn)定性、可靠性等。還有一些基本問題如線性度、檢測極限等。目前，在對GMI效應(yīng)的研究過程中，發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果往往與理論結(jié)果還有很大的差距，因此理論研究需要進一步的深入。在

3、GMI材料方面，還需要進一步探索和優(yōu)化制備條件，如退火處理，幾何尺寸等，尋求最佳的制備工藝條件，制備高性能的GMI傳感器，使其在檢測更低濃度的生物分子方面成為可能。
　　大腸桿菌O157：H7是腸出血性大腸桿菌的主要血清型，能夠?qū)е赂鼓ぱ住⒊鲅阅c炎、膽囊炎、闌尾炎和尿道炎等疾病，嚴(yán)重者甚至死亡。該菌的流行爆發(fā)大多與食用該菌污染的食物有關(guān)，因此建立快速、高靈敏度的檢查方法具有重要意義。C反應(yīng)蛋白(CRP)是由肝細(xì)胞合成，在人的血清

4、、腦脊髓液(CSF)、胸腹水等多種體液中均可被檢測。微生物入侵、炎癥和組織損傷可使CRP水平迅速升高，48小時即可達(dá)峰值，甚至可高3000倍，因此CRP的檢測具有非常重要的意義。肌紅蛋白(Mb)是一種含鐵卟啉的紅色蛋白，其功能是運輸和貯存氧，存在于心肌和骨骼肌，相對分子質(zhì)量較低，為17800，是一種有新看法的老標(biāo)志物。目前普遍用作急性心肌梗死(AMI)的早期診斷。
　　基于以上考慮，本文重點開展了曲折型薄帶的GMI效應(yīng)理論研究、G

5、MI傳感器的MEMS制備技術(shù)以及性能研究、生物分子自組裝膜工藝研究以及基于GMI效應(yīng)的生物標(biāo)志物的檢測研究，包括細(xì)菌和心臟標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白和肌紅蛋白的檢測研究。主要研究工作如下：
　　1．從電感和電阻各自貢獻(xiàn)于阻抗的角度建立了曲折型薄帶的GMI理論模型。研究了尺寸（長度，以及寬度）對單條以及曲折多匝薄帶GMI效應(yīng)的影響，以及匝數(shù)、曲折狀間距和曲折結(jié)構(gòu)對GMI效應(yīng)的影響。結(jié)果表明尺寸、曲折匝數(shù)、曲折狀間距以及曲折結(jié)構(gòu)對薄帶GMI效應(yīng)

6、的峰值和磁場靈敏度均產(chǎn)生了顯著的影響。
　　2．以商品化Co基非晶薄帶作為GMI傳感器材料，采用不同的磁場退火方式，對非晶薄帶進行磁場預(yù)退火處理。運用微細(xì)加工工藝制備了不同尺寸以及不同結(jié)構(gòu)（單條結(jié)構(gòu)和曲折狀結(jié)構(gòu)）的薄帶GMI傳感器。其次結(jié)合微電鍍工藝，制備了三層10匝的NiFe/Cu/NiFe薄膜GMI傳感器。對GMI效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同的磁場退火溫度和不同的磁場退火方式都對GMI效應(yīng)產(chǎn)生了顯著的影響。長度和寬度對單條結(jié)構(gòu)和曲折結(jié)構(gòu)

7、的GMI效應(yīng)影響表現(xiàn)相同。隨著長度增加，GMI效應(yīng)增加；隨著寬度增加，GMI效應(yīng)下降。此外，間距對曲折結(jié)構(gòu)GMI效應(yīng)的影響不明顯。隨著匝數(shù)的增加，GMI效應(yīng)增加，但是匝數(shù)太多，尺寸過大，對于生物傳感測試不太理想。因此采用380℃橫向磁場退火薄帶，設(shè)計較小的寬度和適當(dāng)?shù)拈L度以及適當(dāng)?shù)拈g距的多匝曲折狀薄帶GMI傳感器更適用于生物傳感檢測。同時發(fā)現(xiàn)制備的曲折6匝薄膜傳感器的性能存在差異化，原因是電鍍的NiFe薄膜的性能差異化，因此在生物檢測應(yīng)

8、用方面，需要優(yōu)化選取高性能的薄膜GMI傳感器。
　　3．研究了巰基丙酸單分子自組裝膜工藝，采用了SEM、AFM、XPS等深入研究自組裝膜的質(zhì)量與自組裝膜的工藝條件如溶液濃度、組裝時間等之間的關(guān)系，優(yōu)化出最佳的自組裝膜工藝條件。同時也對EDC和NHS最佳活化時間進行探究。此外研究了細(xì)菌O157：H7單克隆抗體的固定與溫度、時間的關(guān)系，探索合理的固定條件。結(jié)果表明，最佳組裝濃度為20 mmol/l，組裝時間為2小時，活化時間為2小時，

9、單克隆抗體固定的最佳方式為4℃過夜24小時。
　　4．采用MEMS技術(shù)制作了可控的Au薄膜單元以及含Au薄膜單元的開放式微流控部件。開放式微流控部件僅在Au薄膜表面制作了儲液室，用于進行免疫反應(yīng)，結(jié)構(gòu)簡單，便于清洗和去除非免疫成份和磁珠。也便于在電鏡下觀察免疫磁珠是否固定在Au膜單元上及其分布。GMI傳感器對大腸桿菌的檢測，采用了電鍍NiFe/Cu/NiFe三層10匝薄膜 GMI傳感器。GMI傳感器結(jié)合磁標(biāo)記的雙抗夾心免疫檢測方法

10、對大腸桿菌實現(xiàn)了高靈敏檢測、特異性檢測，以及定量檢測。采用分離式檢測的方法，運用1μm磁珠進行捕獲和標(biāo)記大腸桿菌O157：H7，將含不同濃度（100，300,500 cfu/ml）細(xì)菌樣品的Au單元置于傳感器的上方，研究發(fā)現(xiàn)檢測100 cfu/ml O157:H7時，GMI變化可達(dá)到27.4%，實現(xiàn)了高靈敏檢測。其次采用2.8μm磁珠進行捕獲和標(biāo)記細(xì)菌，將含不同濃度（50-1000 cfu/ml）的細(xì)菌樣品的開放式微流控部件分別置于傳感

11、器的邊上，實現(xiàn)了對大腸桿菌的定量檢測，線性檢測范圍為50-500 cfu/ml，檢測極限為50 cfu/ml。此外，采用志賀氏桿菌(Shigella)作為非特異性目標(biāo)分子，進行了非特異性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀測不到明顯的陽性信號。GMI生物傳感器在細(xì)菌檢測方面的應(yīng)用還處于初步階段，本文實現(xiàn)了高靈敏、快速檢測，為將來不同種類細(xì)菌檢測開辟了新的途徑。
　　5．首先采用MEMS技術(shù)制備了集成Au膜的薄帶GMI傳感器，對不同尺寸（1μm和2.8

12、μm）和不同濃度（1-100μg/ml）磁珠進行原位檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)薄帶GMI傳感器對1μm磁珠的檢測極限為5μg/ml，而可以檢測到1μg/ml的2.8μm磁珠。這為后面薄帶GMI生物傳感器檢測C反應(yīng)蛋白提供了基礎(chǔ)。結(jié)合雙抗夾心免疫分析，采用原位測量的方法，薄帶GMI生物傳感器實現(xiàn)了對心臟標(biāo)識物C反應(yīng)蛋白和肌紅蛋白的定量檢測，線性檢測范圍均為1-10 ng/ml，檢測下限分別為1 ng/ml和0.5 ng/ml。其次，利用MEMS技

13、術(shù)制備了封閉式的微流控部件，采用分離式檢測方法，NiFe/Cu/NiFe三層薄膜GMI傳感器對C反應(yīng)蛋白和肌紅蛋白實現(xiàn)了超靈敏聯(lián)合檢測，檢測下限分別為1 pg/ml和0.1 pg/m，檢測上限分別為100 ng/ml和80 ng/ml。對兩種標(biāo)志物的定量檢測分別在低濃度和高濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)，C反應(yīng)蛋白的線性檢測區(qū)間為1 pg/ml-10 ng/ml和10-100 ng/ml，肌紅蛋白的線性檢測區(qū)間為0.1 pg/ml-1 ng/ml和1-