基于PCR放大效應(yīng)的超靈敏分子生物標(biāo)志物檢測(cè)方法研究.pdf

1、PCR技術(shù)具有超高的靈敏性和強(qiáng)大的擴(kuò)增放大效應(yīng),可把痕量核酸甚至僅幾個(gè)分子在幾小時(shí)內(nèi)數(shù)百萬(wàn)倍擴(kuò)增富集,從而使不易檢測(cè)的物質(zhì)方便檢測(cè),使可以檢測(cè)的物質(zhì)達(dá)到痕量檢測(cè).該研究利用PCR技術(shù)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的特性,結(jié)合核酸酶保護(hù)分析技術(shù),進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)和miRNAs的檢測(cè),大大提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度,降低了miRNAs檢測(cè)的難度,初步建立了兩種分子生物標(biāo)志物靈敏、易行、價(jià)廉的檢測(cè)方法.該研究分兩部分:1基于aptamer和核酸外切酶保護(hù)分析技術(shù)的

2、超靈敏蛋白質(zhì)檢測(cè)方法設(shè)計(jì)策略:Aptamer是通過(guò)體外篩選技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中篩選出的一段寡核苷酸序列,它對(duì)相應(yīng)的靶分子有很高特異性和很高親合力.核酸外切酶I(ExoI)催化3'末端羥基的單鏈寡核苷酸從3'端向5'端降解,產(chǎn)生5'單磷酸脫氧核苷和末端二磷酸二核苷.以凝血酶aptamer為例,利用aptamer和ExoI的特性,以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ),我們建立了一種凝血酶高靈敏的檢測(cè)方法稱(chēng)作外切酶保護(hù)分析(Exonuclease Prote

3、ctionAssay,EPA).EPA-PCR凝血酶檢測(cè):將特定濃度的凝血酶稀釋為四個(gè)濃度梯度系列,相鄰濃度相隔2個(gè)數(shù)量級(jí),外切酶保護(hù)分析處理,連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增.同時(shí)將與連接產(chǎn)物序列一致的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成四個(gè)濃度梯度10<'-15>~10<'-9>M,相鄰濃度相隔兩個(gè)數(shù)量級(jí),進(jìn)行PCR擴(kuò)增.EPA一實(shí)時(shí)PCR凝血酶定量檢測(cè):將標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列(10<'-15>~10<'-9>M)和凝血酶濃度系列(2.75×10<'-13>~2.75×10<

4、'-5>M)連接產(chǎn)物進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR,檢測(cè).2 microRNAs的檢測(cè)利用miRNAs長(zhǎng)20~25nt、單鏈、3'羥基、5'磷酸的特點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)了一段與miR-122a序列有關(guān)的59nt寡核苷酸片段和兩端的linkers.然后檢測(cè)肝臟、心臟和腦組織中miR-122a的含量.該試驗(yàn)利用液相雜交技術(shù)和核酸酶保護(hù)分析原理,創(chuàng)建了一種簡(jiǎn)單、價(jià)廉、靈敏度高的miRNAs的檢測(cè)方法,有望成為又一種檢測(cè)miRNAs的方法.各