超分子免疫磁珠定量PCR技術(shù)的建立及大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的探討.pdf

1、大腸癌是在環(huán)境和遺傳因素共同作用下，經(jīng)歷多基因，多步驟、多階段復(fù)雜的生物學(xué)過程演變而來。大腸癌發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典模式是：結(jié)直腸上皮細(xì)胞增生—腺瘤—非典型增生—癌—轉(zhuǎn)移癌。本研究首先應(yīng)用免疫磁珠捕俘技術(shù)和免疫PCR技術(shù)以及熒光定量PCR的原理，設(shè)計并建立一種新的適合血清微量標(biāo)志物的檢測方法—超分子免疫磁珠熒光定量PCR技術(shù)。然后，用這種技術(shù)方法檢測本課題組前期研究中篩選出來的大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因環(huán)氧化酶2基因在大腸癌患者血清中的表達(dá)情況，并深入

2、研究環(huán)氧化酶2在大腸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用并分析其作為大腸癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的可行性。最后，利用整體成像可視化大腸癌原位移植轉(zhuǎn)移動物模型及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定大腸癌不同發(fā)病時期血清中的差異表達(dá)蛋白，尋找新的大腸癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下： 第一章建立大腸癌微量血清標(biāo)志物檢測新技術(shù)一超分子免疫磁珠定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)前選擇大腸癌經(jīng)典標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)作為理想的大腸癌標(biāo)志物，采用已知濃度純化癌胚抗原作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，采用羊

3、抗兔IgG標(biāo)記的DynabeadsM-280SheepAnti-RabbitIgG免疫磁珠作為固相免疫捕俘劑。將生物素標(biāo)記的DNA片段與等摩爾分子的鏈卵白素和等摩爾分子生物素標(biāo)記的大腸癌標(biāo)志物抗體(生物素標(biāo)記鼠抗CEA抗體)進(jìn)行交聯(lián)結(jié)合形成一種超分子復(fù)合物，通過PALL-Microsep100k超濾裝置(內(nèi)含OmegoPES膜)將超分子復(fù)合物進(jìn)行過濾純化，并通過原子力顯微鏡對超分子復(fù)合制成超分子復(fù)合物后開展技術(shù)平臺的構(gòu)建：先在反應(yīng)體系內(nèi)

4、依次加入DynabeadsM-280SheepAnti-RabbitIgG免疫磁珠、兔抗CEA抗體和血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)，通過免疫磁珠特異性吸附將血清中的標(biāo)志物捕俘，然后加入超分子復(fù)合物，由于該復(fù)合物中的生物素化抗體能與捕俘的血清標(biāo)志物特異結(jié)合，其中的模板DNA又能作為免疫熒光PCR的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；將反應(yīng)體系中的復(fù)合物經(jīng)磁力清洗裝置反復(fù)清洗，去除未結(jié)合的雜物，加入熒光定量PCR反應(yīng)；將其靈敏性和可靠性與目前使用的雙

5、抗夾心ELISA法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其敏感性高于目前使用的雙抗夾心ELISA法，使用該技術(shù)平臺能檢測出濃度低至1×10-12g/ml(1pg/ml)的癌胚抗原。 第二章環(huán)氧化酶2與大腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其作用機(jī)制研究 1.環(huán)氧化酶2(COX2)在大腸癌病人血清和大腸癌細(xì)胞系、大腸癌組織的表達(dá) 培養(yǎng)不同轉(zhuǎn)移能力的人大腸癌細(xì)胞系SW480和SW620細(xì)胞，分別用超分子免疫磁珠定量PCR的方法、組織芯片免疫組織化學(xué)、Real-

6、timePCR等方法研究COX2在不同轉(zhuǎn)移能力人大腸癌細(xì)胞系及原發(fā)人大腸癌組織和大腸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織以及大腸癌病人血清中的表達(dá)。 結(jié)果：用超分子免疫磁珠定量PCR檢測平臺檢測。COX2蛋白在SW480和SW620細(xì)胞株中均陽性表達(dá)；在正常大腸粘膜中不表達(dá)，COX2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組的異常表達(dá)高于原發(fā)大腸癌石蠟組織，兩者相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。COX2異常表達(dá)與大腸癌發(fā)病相關(guān)，并可能與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，COX2

7、可以作為大腸癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。 2.環(huán)氧化酶2在大腸癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移中的作用研究 采用BLOCK-iTTMU6RNAiEntryVector試劑盒構(gòu)建干擾COX2基因表達(dá)的RNAi慢病毒干擾載體。按說明書操作流程先根據(jù)invitrogen公司網(wǎng)上公布的shRNA設(shè)計程序(http：//www.invitrogen.com/RNAi)設(shè)計3對shRNA，然后將合成shRNA變?yōu)殡p鏈dsoligo，將3對dsoligo轉(zhuǎn)入p

8、ENTR/U6載體中，將載體轉(zhuǎn)化oneshottop10chemegallycompetentEcoli菌，挑出抗性克隆，提取穿梭質(zhì)粒DNA，測序，分析序列完全準(zhǔn)確后，用構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pENTERTM/U6-shRNA-COX2DNA瞬時轉(zhuǎn)染SW480-EGFP細(xì)胞，挑選出最好的干擾載體pENTERTM/U6-shRNA-3-COX2與慢病毒載體pLenti6/BLOCK-it-DEST進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建穩(wěn)定感染慢病毒干擾載體pLent

9、iU6/COX2ShRNA-3。將慢病毒干擾載體pLentiU6/COX2ShRNA-3轉(zhuǎn)化OneShotStb13感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA。獲得穩(wěn)定COX2干擾的SW480-EGFP-COX2i亞克隆細(xì)胞株。 進(jìn)一步考察了環(huán)氧化酶2被干擾后對SW480-EGFP細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pLentiU6/COX2ShRNA-3后可以使SW480-EGFP-COX2i細(xì)胞的S期細(xì)胞比例增加，并出現(xiàn)少量凋

10、亡細(xì)胞。MTT法觀察SW480-EGFP-COX2i細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示：和未轉(zhuǎn)染組SW480-EGFP細(xì)胞作為對照，SW480-EGFP-COX2i細(xì)胞的增殖速度明顯低于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析差異有顯著性(P＜0.05)；平板集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SW480-EGFP-COX2i細(xì)胞形成的集落數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05)。細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穿過matrigel膠的SW480-EGFP-COX2i細(xì)胞比對照組細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.0

11、5)，說明COX2干擾能降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力。 第三章利用可視化動物模型和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)血清標(biāo)志物 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人大腸癌SW480細(xì)胞，通過G418抗性篩選、亞克隆獲得了G418抗性克隆。該克隆在不施加G418的情況下，SW480細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)EGFP，證明我們已成功地建立了非G418依賴的、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的人大腸癌細(xì)胞株SW48

12、0-EGFP。在腫瘤瘤體明亮熒光的襯托下，借助整體熒光成像系統(tǒng)，我們可以清楚地看到裸鼠移植瘤誘生的宿主新生微血管。移植瘤形成后，我們在無菌環(huán)境下取出移植瘤，將瘤塊剪碎成0.13cm大小的小瘤塊，全麻下于右下腹打開腹腔，暴露腸管，用針頭在回盲部劃痕，造成一小的損傷區(qū)，將瘤塊接種在裸鼠大腸漿膜下肌層，并將瘤塊完全用腸壁包埋，防止暴露于腹腔，然后關(guān)閉腹腔，定時在整體熒光成像系統(tǒng)下觀察原位瘤成瘤以及生長轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示：SW480-EGFP細(xì)

13、胞實(shí)體移植瘤塊大腸原位接種后，收集的這些血清標(biāo)本代表正常情況下、大腸癌發(fā)病荷瘤狀況下和大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移狀況下不同階段的血清學(xué)變化，為下一步研究提供良好的研究基礎(chǔ)。 建立裸鼠大腸癌原位移植整體成像可視化模型后，收集的10只裸鼠原位接種前、原位接種后第1周、第2周、第4周后的血清，分別將同一時期的血清樣品等量混勻，制成4組血清樣品，按Bio-Rad儀器操作手冊進(jìn)行二維電泳，電泳后用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色。將匹配肽段超過4個，MA

14、SCOT得分大于63分的多肽判定為檢測出的差異蛋白。 結(jié)果：將不同時間段血清的2-DE膠結(jié)果圖進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)至少有六個顯著的差異點(diǎn)，經(jīng)過PDQuest7.1軟件包分析后，發(fā)現(xiàn)六個蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)水平明顯改變，表達(dá)水平隨轉(zhuǎn)移程度的增加而升高。用刀片切取6個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解和MALDI-TOF質(zhì)譜分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定了這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)為5種蛋白質(zhì)，它們分別是：結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)α鏈，載脂蛋白

15、A4(ApolipoproteinA-Ⅳ，APOA4)，載脂蛋白E(ApolipoproteinE，APOE)，免疫球蛋白κ型V區(qū)L鏈(IgkappachainVregion，chainL)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，TRF)。 總之，本課題首先建立了超分子免疫磁珠定量PCR這種適用于檢測血清微量標(biāo)志物的新的技術(shù)方法。該方法具有快速、靈敏的特性。與目前使用的雙抗夾心ELISA方法相比具有靈敏性更高的特點(diǎn)，檢測的濃度范圍達(dá)

16、到1×10-12g/ml。隨后我們應(yīng)用超分子免疫磁珠定量PCR技術(shù)檢測檢測COX2在正常人血清和大腸癌病人血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)COX2在大腸癌患者血清中的陽性率高于正常人，而且轉(zhuǎn)移性大腸癌患者血清的COX2陽性率高于非轉(zhuǎn)移癌患者血清；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)COX2基因異常表達(dá)與大腸癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移相關(guān)，COX2可以作為大腸轉(zhuǎn)移標(biāo)志物；通過RNAi技術(shù)干擾COX2基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)COX2能影響大腸癌細(xì)胞的增殖、生長和運(yùn)動能力，促進(jìn)血管生成并促進(jìn)轉(zhuǎn)移形成。

17、最后，我們又利用大腸癌原位移植可視化轉(zhuǎn)移模型及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并鑒定了5個與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的血清標(biāo)志物，即：結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)α鏈，載脂蛋白A4(ApolipoproteinA-Ⅳ，APOA4)，載脂蛋白E(ApolipoproteinE，APOE)，免疫球蛋白κ型V區(qū)L鏈(IgkappachainVregion，chainL)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，TRF)。以上這些研究結(jié)果，為今后更深入研究大