分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方案

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方案 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方案-1 -1一、 一、Southern Southern 雜交 雜交問題 問題 1：電泳后發(fā)現(xiàn)凝膠中 DNA 擴(kuò)散，導(dǎo)致結(jié)果難以確定，如何解決這一問題？解決方案： 解決方案：（1）在操作上：電泳時(shí)隔孔上樣，電泳后要對凝膠及時(shí)處理使凝膠干燥；（2）瓊脂糖的質(zhì)量應(yīng)該較好，尤其是不應(yīng)含有內(nèi)切酶，否則有時(shí)將使低拷貝數(shù)基因的雜交結(jié)果難以解釋。問題 問題 2：傳統(tǒng)方法中轉(zhuǎn)膜不完全的

2、問題如何克服？解決方案： 解決方案：經(jīng)典的向上轉(zhuǎn)移法會(huì)使凝膠短時(shí)間內(nèi)變薄,此時(shí)即使延長轉(zhuǎn)移時(shí)間至24 小時(shí)以上,也不能使大分子 DNA 良好地轉(zhuǎn)移出去,因此,轉(zhuǎn)膜不完全。向下轉(zhuǎn)膜法由于不需在吸水紙上增加重量,凝膠基本不變形；加之吸水紙的吸力與水受到的重力方向一致,故可以良好地完成 DNA 的轉(zhuǎn)移,它不需要特殊的儀器,轉(zhuǎn)移速度較快,轉(zhuǎn)移效率高。利用地高辛標(biāo)記探針進(jìn)行 Southern 雜交時(shí)，對于大于 15kb 的 DNA 片斷，轉(zhuǎn)膜之前

3、用鹽酸進(jìn)行脫嘌呤可以促進(jìn)轉(zhuǎn)膜效率, 但脫嘌呤過度可導(dǎo)致分子量相對較小的 DNA 被打斷成過小的片段而難以和尼龍膜結(jié)合。如果實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)膜過程中同時(shí)含有大于 15kb 的 DNA(通常為基因組)和小片段 DNA(通常是基因組酶切產(chǎn)物)，那么在轉(zhuǎn)移的過程中傾斜容器，僅使凝膠上半部分浸泡于鹽酸，這樣既可以提高大片斷 DNA 的轉(zhuǎn)移效率，又不會(huì)打碎小片段 DNA。另外，等采用瓊指糖凝膠直接雜交的方法，來解決這一難題：以轉(zhuǎn)基因鼠的檢測為例，實(shí)驗(yàn)步驟如下

4、：1.轉(zhuǎn)基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因 5’調(diào)控區(qū)指導(dǎo)人 G-CSF 基因?yàn)闃?gòu)件，建立轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測采用剪取鼠尾 DNA 做 Southern 進(jìn)行鑒定。2.瓊脂糖凝膠直接雜交:(l)用 BanHI(150U)對由假孕鼠產(chǎn)生的仔鼠剪尾提取基因組 DNA10μg 酶切過液，取少量電泳檢查酶切完全后，上樣電泳 8 小時(shí)，(2)將電泳槽板連同凝膠置 50℃放置 3 小時(shí)，用鑷子輕輕揭起凝膠，放于變性液(0.5MNaO

5、H，0.5MNaCl)20 分鐘，轉(zhuǎn)置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20 分鐘，將膠放于玻璃板上瀝干液體，室溫放置 30分鐘。(3)干膠應(yīng)立即雜交。先將膠在水中泡一下，以利于操作。(4)將膠放人解決方案： 解決方案：將煮沸的 5g/LSDS 溶液倒在膜上,待溶液自然冷卻至室溫,可除去膜上已雜交的 DNA 探針。洗脫后的尼龍膜,可反復(fù)用于其他探針的雜交(至少可耐5 輪雜交與洗脫)。問題 問題 6：Southern 雜

6、交中，探針的背景高，應(yīng)如何解決？解決方案： 解決方案：用隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針要想得到最低的背景，在向尼龍膜上加prob-DIG Easy H yb 混合物前,要用 0.45μm 醋酸纖維素膜過濾，勿用硝酸纖維素濾膜過濾。對每一個(gè)探針和目的片段，總是要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定最合適的雜交條件，探針濃度很關(guān)鍵，如果太高，將會(huì)非特異性結(jié)合到膜上；太低，敏感性會(huì)降低。利用地高辛標(biāo)記探針進(jìn)行 Southern 雜交時(shí)，以下 2 種措施可降低背景：(1)適當(dāng)延

7、長梯度洗膜的時(shí)間和提高洗膜溫度；(2)控制地高辛抗體的濃度。使用足夠量的地高辛抗體可以獲得較好的雜交信號(hào), 但過量的地高辛抗體會(huì)在膜上產(chǎn)生非特異結(jié)合斑點(diǎn)。問題 問題 7：Southern 雜交沒有檢測出出雜交信號(hào)的原因，如何解決？解決方案： 解決方案：（1）目的 DNA 在總 DNA 中所占的比例，一般需要 10μg DNA 樣品, 如果樣品中目的基因含量較高, 可以按比例減少 DNA 用量。如果基因組中目的基因的拷貝數(shù)較低, 致使常規(guī)

8、的基因組用量不能滿足 Southern 雜交的需要, 此時(shí)可加大基因組的用量；（2）探針的濃度和比活性：在雜交袋中雜交需要0.2ml/cm2 的雜交液；使用圓筒狀瓶子進(jìn)行雜交可以使用較小的體積，約 0.1ml/cm2。（3）轉(zhuǎn)移到濾膜上的 DNA 量以及探針與目的 DNA 間的配對：（見問題 2，3）二、藍(lán)白斑篩選 二、藍(lán)白斑篩選問題 問題 1：做藍(lán)白斑篩選只見白斑，不見藍(lán)斑，該如何做？解決方案： 解決方案：（1）做空白對照，將沒有進(jìn)行