綠原酸、葛根黃酮、松針多糖及其復(fù)合物免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)、松針多糖(Polysaccharides from pine needles)及葛根黃酮(Pueraria flavone，RPI)是三種分布廣泛、較易獲得的天然產(chǎn)物，具有多種生理活性。為了研究其在免疫應(yīng)答中的作用，本文采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為模型，研究了綠原酸、葛根黃酮、松針多糖及其復(fù)合物對靜息狀態(tài)及LPS激活狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制。通過腹腔注射法提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

2、，MTT（噻唑藍(lán)）比色法檢測細(xì)胞代謝活力，中性紅吞噬實驗檢測巨噬細(xì)胞的吞噬能力，Griess試劑盒法檢測細(xì)胞產(chǎn)生NO的量，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α及抑炎細(xì)胞因子IL-10的分泌水平，RT-PCR法檢測細(xì)胞細(xì)胞因子及I型干擾素基因表達(dá)量，West-blot測定MAPK通路下p38MAPK、JNK和ERK以及各自的磷酸化蛋白含量的變化，探討復(fù)合物的免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果如下：

3、r>　　(1)不同濃度的CGA均能顯著促進(jìn)靜息狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，在濃度為25~100μg/mL時可提高巨噬細(xì)胞代謝活力，高劑量(50~100μg/mL)的CGA可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)IL-1β、TNF-α的分泌并減少IL-10的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，且呈現(xiàn)劑量依賴性；當(dāng)巨噬細(xì)胞處于LPS刺激狀態(tài)時，在CGA濃度為25~100μg/mL可協(xié)同LPS增強(qiáng)其吞噬能力、促進(jìn)IL-1β的釋放；高劑量(50~100μg/mL)

4、的CGA能增加促炎細(xì)胞因子TNF-α的釋放，減少抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌量。
　　(2)不同濃度RPI均能促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，在濃度大于12.5μg/mL時可抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及TNF-α，高濃度(50~100μg/mL)的RPI可抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力、促進(jìn)IL-10的釋放，且呈劑量依賴性；當(dāng)巨噬細(xì)胞處于LPS刺激狀態(tài)時，高濃度的RPI能抑制LPS對巨噬細(xì)胞中NO和IL-1β的產(chǎn)生，當(dāng)RPI濃度小于25μg

5、/mL時，LPS加RPI共刺激對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和TNF-α無影響。
　　(3)不同濃度的松針多糖均能促進(jìn)靜息狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，當(dāng)其濃度大于25μg/mL時能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)TNF-α和IL-1β的釋放。高濃度的(100~200μg/mL)松針多糖能顯著抑制IL-10的產(chǎn)生；不同濃度的松針多糖均能協(xié)同LPS釋放大量TNF-α。當(dāng)松針多糖濃度大于50μg/mL時，LPS松針多糖共刺激組能顯著地增強(qiáng)巨噬

6、細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO、促炎因子TNF-α和IL-1β，抑制IL-10的產(chǎn)生，并呈劑量依賴性。
　　(4)通過對葛根黃酮、松針多糖及綠原酸三種物質(zhì)作為單因素進(jìn)行正交試驗，結(jié)果分析得出，當(dāng)復(fù)合物中CGA濃度為100μg/mL，RPI濃度為50μg/mL，松針多糖濃度為200μg/mL時協(xié)同效果最佳，能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子及NO的量，且效果最佳。RT-PCR結(jié)果顯示，復(fù)合物能促進(jìn)靜息狀態(tài)及經(jīng)LPS刺激

7、狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和I型干擾素分泌表達(dá)量，抑制抑炎細(xì)胞因子IL-10基因表達(dá)，且效果顯著。
　　(5)復(fù)合物單獨刺激、LPS共刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞一定時間(0h，4h，8h)后，檢測MAPK信號通路的p38MAPK、ERK、JNK及其磷酸化蛋白表達(dá)量，結(jié)果表明：復(fù)合物單獨刺激及LPS復(fù)合物共刺激組4h和8h時，ERK、p-ERK表達(dá)量下降，p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-J