基于Toehold介導(dǎo)的DNA鏈置換構(gòu)建電化學(xué)傳感MicroRNAs與凝血酶的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著基因診斷與治療、藥物篩選與作用機理探究、環(huán)境污染與食品安全監(jiān)測等諸多研究領(lǐng)域蓬勃迅速的發(fā)展，實現(xiàn)對病原蛋白和特定序列microRNA(miRNA)的方便、耗時少、高靈敏且高特異性分析檢測的意義是非常重要的。電化學(xué) DNA生物傳感器(DNA electrochemical biosensor)因為其自身構(gòu)造簡單、易實現(xiàn)便攜性、成本低廉、高靈敏且特異性強等優(yōu)點而備受關(guān)注。目前，對于研究者們來說，開發(fā)電化學(xué)DNA生物傳感器在生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)

2、領(lǐng)域已成為具有吸引力和極具挑戰(zhàn)的前沿性課題。粘性末端(Toehold)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(Toehold-mediated strand displacement reaction，TSDR)是構(gòu)建動態(tài)DNA納米機器的基礎(chǔ)反應(yīng)。本文結(jié)合TSDR輔助目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了三種電化學(xué)DNA生物傳感器，實現(xiàn)了對miRNA和凝血酶的超靈敏檢測，具體研究工作如下：
　　1.基于 DNA分子機器實現(xiàn)無酶目標(biāo)物循環(huán)放大和最小化背景噪聲的電化學(xué)檢

3、測癌細(xì)胞中的MicroRNA
　　MicroRNA(miRNA)表達水平的變化是可以作為診斷不同癌癥的有用生物標(biāo)記物。在本項工作中，基于miRNA引發(fā)無酶目標(biāo)物循環(huán)信號放大分子機器，我們開發(fā)了一個簡單新穎的電化學(xué)DNA生物傳感器實現(xiàn)高靈敏地檢測人乳腺癌細(xì)胞中的miRNA-21。相應(yīng)傳感器的制備是由3條單鏈DNA組成的雙鏈探針通過自組裝在金電極表面上，目標(biāo)物miRNA-21結(jié)合到雙鏈探針的末端第一個toehold區(qū)域，將其中一條短D

4、NA鏈置換下來,并暴露出第二個toehold區(qū)域用于隨后與亞甲藍(MB)修飾的燃料 MB-DNA鏈進行雜交反應(yīng)，MB-DNA鏈進一步置換出miRNA-21和另一短鏈DNA以激活分子機器的操作。結(jié)果，目標(biāo)miRNA-21循環(huán)重復(fù)使用，導(dǎo)致許多MB-DNA燃料鏈連接到傳感器表面產(chǎn)生明顯放大的電流響應(yīng),實現(xiàn)對miRNA-21的高靈敏檢測，檢測限低至1.4 fmol/L。我們開發(fā)的傳感器對目標(biāo)物表現(xiàn)出很強的序列特異性，同時可用于在癌細(xì)胞樣品中檢

5、測miRNA-21。此外，不僅該傳感器的構(gòu)建有使用目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)避免了任何酶參與的優(yōu)點，而且還有高度最小化減少背景噪聲的優(yōu)點。使得該方法可以方便地監(jiān)測不同miRNA生物標(biāo)志物，具有對各種癌癥的早期診斷中有巨大潛力。
　　2.基于級聯(lián)鏈置換無酶介導(dǎo)目標(biāo)物循環(huán)放大和免標(biāo)記電化學(xué)檢測腫瘤細(xì)胞的MicroRNA
　　痕量檢測miRNA在腫瘤細(xì)胞中的表達水平對于癌癥診斷具有非常重要意義。本項工作中，基于兩個級聯(lián) toehold介導(dǎo)

6、的鏈置換反應(yīng)(TSDRs)，我們設(shè)計了一個免標(biāo)記和無酶輔助目標(biāo)物循環(huán)放大的電化學(xué)方法檢測人乳腺癌細(xì)胞中的miRNA-21。含有被鎖定的G-四鏈體序列的“Y”型DNA探針通過自組裝在傳感器表面上。當(dāng)目標(biāo)物miRNA-21存在的時候，引發(fā)第一個TSDR使“Y”型DNA探針解體的同時釋放活性G-四鏈體序列。隨后，DNA燃料鏈觸發(fā)第二個TSDR，使得miRNA-21循環(huán)再利用。通過級聯(lián)TSDR，傳感器表面上產(chǎn)生許多活性G-四鏈體序列，其與hem

7、in結(jié)合以產(chǎn)生顯著放大的電流響應(yīng)，實現(xiàn)靈敏檢測miRNA-21低至1.15 fmol/L。該傳感器表現(xiàn)出具有很強的選擇性，并且可以用于檢測來自人乳腺癌細(xì)胞樣品中的miRNA-21。
　　3.基于結(jié)合目標(biāo)物催化發(fā)夾自組裝(CHA)和TdT催化DNA聚合雙信號放大策略電化學(xué)檢測人血清中的凝血酶
　　對蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的特異和靈敏性檢測在生物醫(yī)學(xué)和生物分析應(yīng)用中具有非常重要的意義。該項工作中，實現(xiàn)了基于集成催化發(fā)夾自組裝(CHA)

8、和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)原位DNA聚合的雙放大信號放大技術(shù)，高靈敏和免標(biāo)記的電化學(xué)方法檢測人體血清中的凝血酶。當(dāng)目標(biāo)物凝血酶的存在情況下，傳感器電極上捕獲的具有游離3'-OH末端的發(fā)夾DNA信號探針。隨后，在dGTP與dATP摩爾比為6:4的情況下，TdT可以催化信號探針的游離3'-OH末端延伸形成許多重復(fù)的G-四鏈體序列，G-四鏈體序列結(jié)合hemin并產(chǎn)生顯著放大的電流響應(yīng)，實現(xiàn)超靈敏并且完全無標(biāo)記的方式檢測凝血酶，靈敏度達到