1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 產(chǎn)生毒副作用是腫瘤藥物治療失敗的關(guān)鍵性因素?；谀[瘤組織高表達(dá)Legumain和CD44(透明質(zhì)酸受體)的生物學(xué)特性，我們?cè)O(shè)計(jì)、制備了基于透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的Legumain響應(yīng)釋放阿霉素載體，使阿霉素（Doxorubicin，DOX）在Legumain及CD44高表達(dá)的惡性腫瘤組織中聚集、釋放，提高藥物對(duì)腫瘤組織的靶向性，增加藥物的治療效果。藥物的靶向運(yùn)輸和緩釋是增加藥物的治療效果和
2、減少藥物的副作用的一項(xiàng)重要措施，本項(xiàng)目的實(shí)施對(duì)于探索腫瘤藥物靶向治療新方法具有重要的理論和實(shí)踐意義。
實(shí)驗(yàn)方法：
為了實(shí)現(xiàn)Legumain響應(yīng)釋放的效果，首先將DOX與Legumain的底物多肽（PEP）化學(xué)鍵合，形成阿霉素-多肽衍生物（DOX-PEP）。用柱層析的方法分離純化，得到DOX-PEP純品，并用ESI-MS、NMR等對(duì)DOX-PEP進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。隨后將DOX-PEP在EDC/NHS催化下，嫁接到HA的羧基
3、上，并用微乳化法在ADH作用下進(jìn)一步交聯(lián)，形成多面體狀的HA-PEP-DOX載藥納米粒子。應(yīng)用馬爾文粒度分析儀測(cè)定納米顆粒的粒徑、Zeta電位、多分散指數(shù)（PDI），并評(píng)價(jià)納米顆粒在酸性條件（pH5.0）和中性條件（pH7.0）下的穩(wěn)定性。使用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒子的形貌特征。使用UPLC-MS-MS檢測(cè)Legumain敏感的納米藥物的體外釋放情況。使用雙掃描激光共聚焦顯微鏡觀察各細(xì)胞對(duì)藥物的攝取
4、并用流式細(xì)胞術(shù)定量細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。使用CCK-8評(píng)價(jià)藥物的細(xì)胞毒性。構(gòu)建A549人肺癌異種移植瘤模型，將透明質(zhì)酸包載藥物及游離DOX通過尾靜脈注入動(dòng)物體內(nèi)，定時(shí)取血，熒光法測(cè)定血清中阿霉素總量（包括釋放和未釋放），并用UPLC-MS-MS測(cè)定釋放的藥物濃度（DOX-Leu）。以獲得該納米藥物在體內(nèi)的緩釋及Legumain響應(yīng)性質(zhì)。提取正常組織和腫瘤組織的蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)提取的粗蛋白進(jìn)行 Legumain酶活性評(píng)價(jià)。用
5、 Cy5.5近紅外熒光探針標(biāo)記HA-PEP-DOX納米藥物，并將其及游離Cy5.5通過尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在不同時(shí)間點(diǎn)觀察近紅外熒光發(fā)射強(qiáng)度（激發(fā)光670 nm，發(fā)射光710 nm），觀察納米藥物的體內(nèi)分布及腫瘤靶向性。使用酶標(biāo)儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的荷瘤小鼠各組織PBS提取液中DOX的熒光信號(hào)（激發(fā)光470 nm，發(fā)射光590 nm），以定量納米藥物及游離藥物的組織分布情況。為了研究納米藥物的體內(nèi)抗腫瘤功效，將游離DO
6、X、納米藥物及PBS經(jīng)尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，首次給藥后40天內(nèi)觀察小鼠的腫瘤體積及存活率。將經(jīng)一段時(shí)間藥物治療的荷瘤小鼠的腫瘤組織及心、肝、脾、腎等正常組織取出制成石蠟切片，并對(duì)腫瘤組織的切片進(jìn)行H&E染色，TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及Ki-67免疫組織化學(xué)染色，以評(píng)價(jià)腫瘤組織的組織學(xué)變化及細(xì)胞凋亡情況。對(duì)正常組織的石蠟切片進(jìn)行H&E染色，TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)藥物的系統(tǒng)毒性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
核磁共振譜圖證明阿霉素
7、及其多肽衍生物已成功合成并成功將其接到HA上。納米粒子粒徑約為400 nm，PDI約為0.2。TEM及SEM結(jié)果表明，納米粒子粒徑約為300-500 nm，為多面體結(jié)構(gòu)。藥物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，納米粒子在生理?xiàng)l件（pH7.0）下較穩(wěn)定，而在酸性條件（pH5.0）下穩(wěn)定性較差。體外釋放結(jié)果表明，藥物釋放受Legumain調(diào)控。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，癌細(xì)胞（A549， MCF-7和MCF-7/ADR）及正常細(xì)胞（L929）對(duì)納米粒子的攝取量均高于對(duì)
8、游離DOX的攝取量。并且，癌細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取比正常細(xì)胞更顯著。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，相同藥物濃度下，納米粒子對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性更顯著，對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性不明顯；而游離DOX對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性不明顯，當(dāng)其作用于正常細(xì)胞（L929）時(shí)，一半以上的細(xì)胞活力被抑制。小鼠血藥濃度變化情況表明，載藥納米粒子具有很好的緩釋作用。提取的粗蛋白樣品的Legumain酶活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，腫瘤組織的Legumain活性顯著高于其它組織。用腫瘤組織提取的蛋白
9、與透明質(zhì)酸包載的藥物共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，藥物釋放顯著增加。小動(dòng)物體內(nèi)成像結(jié)果顯示，納米藥物可在腫瘤組織中累積、釋放，具有良好的緩釋性和腫瘤靶向性。使用酶標(biāo)儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的荷瘤小鼠各組織PBS提取液中DOX的熒光信號(hào)，結(jié)果表明注射納米藥物的荷瘤小鼠腫瘤組織中DOX的熒光值是游離DOX組的5倍，并且與游離DOX相比，HA-PEP-DOX納米藥物在心臟、肝臟和腎臟中分布很少。納米藥物體內(nèi)抗腫瘤特性研究結(jié)果顯示，對(duì)照組的腫瘤體積隨時(shí)間變化快速增加；
10、游離DOX可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，但對(duì)小鼠具有全身毒性，這會(huì)影響小鼠的存活率；而我們制備的納米藥物可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)且毒性較低，具有很高的治療功效。荷瘤小鼠的心、肝、脾、腎及腫瘤組織切片的H&E染色，TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和Ki-67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對(duì)照組的腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛；藥物治療組（游離DOX及納米藥物處理組）的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中， HA-PEP-DOX納米藥物治療組的腫瘤組織尺寸減小，具有最高的細(xì)胞凋亡率和壞死率，并且對(duì)正
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