幾類含鐵酶和糖相關(guān)酶催化反應機理的理論研究.pdf

1、本論文主要使用量子力學與分子力學組合(QM/MM)的方法系統(tǒng)地探討幾類重要的含鐵酶和糖相關(guān)酶的催化反應機理。通過理論研究深入探討了酶與底物的作用機制和酶催化反應的詳細歷程，確定了催化反應的最優(yōu)路徑、反應過程中涉及到的過渡態(tài)和中間體的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的能量學信息，明確了酶活性中心一些關(guān)鍵殘基的重要作用。研究結(jié)果不僅能夠與現(xiàn)有的一些實驗結(jié)果很好地吻合，還對實驗結(jié)果做了進一步的補充。這些理論研究對實驗上探討相關(guān)酶的催化機理及實際應用都有一定的指導

2、意義。
　　本論文的主要研究工作如下:
　　(1)碳青霉烯合成酶(CarC)催化機理的理論研究
　　碳青霉烯是β-內(nèi)酰胺類抗生素的一個重要分支，與其它β-內(nèi)酰胺類抗生素相比，碳青霉烯類的抗菌譜更廣，抗菌活性更強，且對β-內(nèi)酰胺酶表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。然而，近年來越來越多的研究表明細菌對碳青霉烯的抗藥性正在增加。因此，深入研究碳青霉烯的生物合成機制對制藥工程上設計新的碳青霉烯變體以抵抗細菌的抗藥性顯得尤為重要。簡單的天然碳

3、青霉烯-3-羧酸的生物合成只需要三種酶，其中一種是碳青霉烯合成酶（CarC）。CarC屬于FeⅡ和2-羰基酮戊二酸依賴的氧化酶家族，在碳青霉烯生物合成路徑中，CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷發(fā)生C5-差向異構(gòu)化和C2/3-去飽和化反應轉(zhuǎn)化成(5R)-碳青霉烯?；谠缙贑lifton等人報道的晶體結(jié)構(gòu)，實驗和理論計算都對差向異構(gòu)化和去飽和化機理進行了研究。但是考慮到這個晶體結(jié)構(gòu)是不完整的，其中缺失了活性位點附近的兩部分關(guān)鍵loop區(qū)，

4、先前建議的反應機理的合理性值得懷疑。最近，實驗上報道了CarC的完整晶體結(jié)構(gòu)，使得我們可以通過QM/MM計算探討其詳細的催化機理。我們首先分析了O2在金屬上的結(jié)合位點，并識別出FeⅣ=O有兩種潛在的朝向:其氧基正對著His101或者正對著His251。前者能量上很不穩(wěn)定且不能與底物反應，但是它可以通過氧基的旋轉(zhuǎn)快速異構(gòu)化成后者。殘基Arg67在調(diào)控雙氧結(jié)合和協(xié)助FeⅣ=O異構(gòu)化方面起著重要作用。與早期理論計算建議的耦合的差向異構(gòu)化和去飽

5、和化反應不同，QM/MM計算結(jié)果明確支持分步的差向異構(gòu)化和去飽和化反應，整個催化反應需要兩個完整的氧化循環(huán)。在差向異構(gòu)化反應中，CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷轉(zhuǎn)化成初始產(chǎn)物(3S,5R)-碳青霉烷，反應涉及到H5原子奪取、C5-自由基的翻轉(zhuǎn)和反向C5-H鍵的重建。在去飽和化反應中，(3S,5R)-碳青霉烷以一個新的朝向重新結(jié)合進CarC的活性位點。C2-C3去飽和化反應中除了FeⅣ=O沒有涉及到任何活性位點殘基。計算結(jié)果表明與(3

6、S,5S)-碳青霉烷相比，(3S,5R)-碳青霉烷中間體更適合作為CarC的底物。在CarC的作用下，(3S,5R)-碳青霉烷中間體可以通過高效的去飽和化反應直接轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物（5R)-碳青霉烯。此外，在CarC催化反應中，底物羥基化一直與目標異構(gòu)化和去飽和化反應競爭。我們的研究提供了詳細合理的CarC催化機理，這對碳青霉烯抗生素的生物合成工程有一定的指導意義。
　　(2)工程細胞色素P450BM3酶催化機理的理論研究
　　

7、典型的P450酶通常催化O2參與的C/N-H鍵活化、烯烴環(huán)氧化、醛/酮烯化反應等。與酶催化的烯烴環(huán)氧化反應類似，有機合成上經(jīng)常通過把等電子的卡賓轉(zhuǎn)移給烯烴來得到新的環(huán)丙烷產(chǎn)物，但是這種反應在生物體內(nèi)幾乎不可能發(fā)生。受P450酶催化的化學、區(qū)域和立體選擇性的啟發(fā)，Arnold課題組于2013年首次報道了P450BM3酶的工程變體催化烯烴的環(huán)丙烷化反應。近年來的研究發(fā)現(xiàn)工程P450酶還能催化C-H胺化反應、硫亞胺化反應、氮雜環(huán)丙烷化反應等。

8、這些研究不僅豐富了P450酶的應用價值，也對實驗上設計其他的一些新酶催化合成更多的自然界不常見的反應提供了一個堅實的基礎。遺憾的是，到目前為止工程酶催化反應機理的理論研究依然鮮有報道。以工程P450BM3酶催化的烯烴環(huán)丙烷化反應為例，盡管實驗上通過設計一些P450變體并使用不同的疊氮酯試劑和烯烴，已經(jīng)充分證明了這種反應的可行性和可調(diào)性，但是并沒有從微觀水平上對環(huán)丙烷化反應機理以及反應的立體選擇性進行更深層次的探索。在本章中，我們應用QM

9、和QM/MM方法詳細研究了工程P450BM3酶催化的苯乙烯環(huán)丙烷化機理以及反應的立體選擇性。QM計算結(jié)果表明不管Fe-卟啉卡賓的軸向配體是巰基還是羥基，其基態(tài)都是三重自旋態(tài)，這也與QM/MM計算結(jié)果一致。Fe-卟啉卡賓是一個高活性的中間體，在三重態(tài)勢能面上Fe-卟啉卡賓很容易與苯乙烯的末端烯基反應生成一個C-自由基中間體，隨后C-自由基進攻Fe-C鍵上的C原子得到最終的環(huán)丙烷化產(chǎn)物。反應的立體選擇性只取決于疊氮酯試劑和苯乙烯在工程P45

10、0BM3酶活性中心的相對朝向，而不能僅僅從某一種固定的相對朝向出發(fā)通過在反應中旋轉(zhuǎn)苯基或者酯基來實現(xiàn)。QM/MM計算進一步發(fā)現(xiàn)，把工程P450BM3-CIS酶中Fe的軸向半胱氨酸配體突變成絲氨酸在一定程度上有利于cis產(chǎn)物的形成，這與實驗結(jié)果基本一致。這些理論研究揭示了工程P450BM3酶催化的立體選擇性的本質(zhì)，對實驗上設計新的P450酶變體以提高反應的立體選擇性具有重要的指導意義。
　　(3)尿苷二磷酸連接糖氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(W

11、lbB)催化機理的理論研究
　　氮-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(NAT)是最大的超酶家族之一，它能催化乙酰基輔酶A(acetyl-CoA)轉(zhuǎn)移其乙?；礁魇礁鳂拥氖荏w底物的氨基上。研究證實NAT參與很多的生理活動，例如:人體中致癌物的活化和解毒、細菌中氨基甙抗生素的滅活、組蛋白修飾以及脊椎動物的睡眠-覺醒周期等。ManNAc3NAcA是一種不常見的雙氮-乙?；拿撗跆?，廣泛存在于一些革蘭氏陰性病菌的外膜中，其前驅(qū)體是UDP-ManNAc3NA

12、cA，通常由五種酶聯(lián)合催化合成得到。第四種酶在Bordetella pertussis中也稱作WlbB，是一種氮-乙?；D(zhuǎn)移酶，它催化尿苷二磷酸-2-乙酰氨基-3-氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NA)轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸-2,3-二乙酰氨基-2,3-二脫氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAe3NAcA)。本文使用QM/MM方法探討了WlbB催化的乙酰基化機理。乙?；磻窃诘孜锏膮f(xié)助下完成的，沒有任何活性位

13、點殘基直接參與。與實驗上建議的氧負離子四面體中間體不同，通過計算發(fā)現(xiàn)反應會經(jīng)歷一個帶負電荷的CoA和一個帶正電荷的中間體。盡管殘基Asn84沒有直接參與酶催化反應，但是其在合理定位底物氨基上的孤電子對朝向及穩(wěn)定過渡態(tài)和中間體方面起著重要作用。此外，理論研究還發(fā)現(xiàn)一個合理的初始酶-底物復合物結(jié)構(gòu)對準確探討酶催化機理并獲得合理的能量關(guān)系至關(guān)重要。
　　(4)脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesⅣ)催化機理的理論研究
　

14、　脫氧糖是一類重要的碳水化合物，廣泛存在于細菌細胞表面的糖蛋白、脂多糖和糖脂中，也存在于很多微生物二級代謝產(chǎn)物中。D-脫氧糖胺就是一種典型的脫氧糖，它不僅參與很多的生命活動，還是一些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如酒霉素、嘌呤霉素和紅霉素等的重要組成部分。臨床研究表明在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中如果存在脫氧糖，它們的生物活性會明顯增強。相反，如果從這些藥物中移除脫氧糖，它們的藥理特性會被減弱甚至被消除。脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶(DesⅣ)是D-

15、脫氧糖胺生物合成路徑中必需的一種酶，它催化脫氧胸苷二磷酸-葡萄糖(dTDP-glucose)轉(zhuǎn)化成脫氧胸苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖（dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose）。
　　(5)尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)催化機理的理論研究
　　尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脫水酶(TunA)是短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族的一個特殊成員，它催化尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺(UD

16、P-GlcNAc)轉(zhuǎn)化成尿苷二磷酸-4-酮基-氮-乙酰葡糖胺-5,6-烯（UDP-4-keto-GlcNAc-5,6-ene）。TunA是衣霉素生物合成路徑中必需的一種酶。衣霉素是一種重要的酰基核苷類抗生素，它能夠抑制具有包膜的病毒的繁殖，是醫(yī)學上常用的抗生素之一。本文通過QM/MM計算詳細探討了TunA的催化機理。與DesⅣ類似，TunA催化反應也可劃分成氧化、脫水和還原三個連續(xù)的化學步驟。氧化步是一個吸熱反應，能壘是21.6 kca

17、l/mol,并且它以一個協(xié)同異步的機理進行。脫水反應以E1cB機理進行，包含質(zhì)子轉(zhuǎn)移和羥基消除兩步。殘基Glu121先作為一個廣義堿然后再作為酸參與水的消除反應，而Cys120雖然沒有直接參與反應，但是它在維持活性位點排布方面起著重要作用。還原步是氧化反應的逆反應，也是以協(xié)同異步機理進行，只不過氫負離子轉(zhuǎn)移先于質(zhì)子轉(zhuǎn)移發(fā)生。通過理論計算我們修訂了先前實驗上建議的TunA的催化機理，這能為其它SDR家族成員的催化機理研究提供一定的理論指導

18、。
　　(6)果膠酸裂解酶(BsPel)催化機理的理論研究
　　膠質(zhì)不僅是植物細胞壁的重要組成部分，參與很多的生化過程，還是食品工業(yè)上廣泛使用的增稠劑和穩(wěn)定劑。在植物軟腐爛過程中，果膠酸裂解酶是解聚膠質(zhì)必不可少的一種酶，其催化聚半乳糖的α-1,4糖苷鍵裂解，產(chǎn)生4,5-不飽和的寡半乳糖。雖然實驗上已經(jīng)對很多植物致病菌中的果膠酸裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能進行了大量的研究并取得了很多重要進展，但到目前為止還沒有對其催化應機理進行系統(tǒng)的理