2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分薯蕷皂苷經5-LO/LTB4途徑對TNF-α誘導FLS損傷的保護作用及機制
  研究背景和目的:
  類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節(jié)滑膜異常增生為主要特征的自身免疫疾病?;ぎ惓T錾c滑膜細胞的凋亡和增殖失衡有關,其中成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)作為血管翳形成的主要細胞,由于凋亡不足積極參與RA的進程。RA患者FLS的

2、特征是呈腫瘤樣擴張,在血管翳形成、軟骨和骨侵蝕中具有中心作用。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)產生于RA免疫反應的早期,能夠誘導體內很多細胞產生炎性細胞因子白細胞介素-6(Interleukin6, IL-6)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白細胞介素-8(Interle

3、ukin8,IL-8)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase2,COX-2)、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)等,促進滑膜增生,參與RA等炎癥免疫反應。薯蕷皂苷(Dioscin,Dio)具有調節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集等多種藥理作用,表明了其廣闊的應用前景。本實驗我們采取TNF-α體

4、外誘導FLS作為RA的離體模型,探索Dio對TNF-α誘導Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎模型(CollagenⅡinduced arthritis,CIA)大鼠FLS(RAFLS)的治療作用及其機制。
  方法:
  1.將0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml TNF-α與RAFLS共同孵育24h、48h、72h,MTT法檢測

5、細胞存活率,確定TNF-α誘導RAFLS的最佳濃度和時間。
  2.將0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml Dio與TNF-α誘導的RAFLS共同孵育24h、48h、72h檢測細胞存活率,確定Dio對TNF-α誘導RAFLS作用的合適濃度和時間。
  3. ELISA檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1

6、μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg/ml組細胞培養(yǎng)上清中白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4)含量的變化。
  4.實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative transcription polymerase chain reaction, Q-PCR)檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg

7、/ml組細胞中5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)、白三烯A4水解酶(Leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)、白三烯B4受體1(Leukotriene B4 receptor1,BLT1)、白三烯B4受體2(Leukotriene B4 receptor1,BLT2) mRNA的表達變化。
  5.蛋白印跡檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg

8、/ml組、Dio4μg/ml組細胞中5-LO、LTA4H蛋白的表達變化。
  6.免疫熒光檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg/ml組細胞中LTA4H蛋白的表達變化。
  結果:
  1.與對照組相比,2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量組TNF-α與RAFLS共同孵育24h、48h、72h均能顯著提高細胞的存活率,且

9、10ng/ml劑量組TNF-α處理組RAFLS增殖促進作用最為明顯(P<0.05)。綜合考慮,以后的實驗我們選用終濃度為10ng/ml TNF-α處理24h制作細胞模型。
  2.與TNF-α模型組相比,1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml劑量組Dio能夠時間劑量依賴性的抑制TNF-α誘導的RAFLS的增殖(P<0.05)。3μ

10、g/ml劑量組Dio作用于RAFLS24h后,細胞存活率達到49.46±1.33,接近50%。綜合考慮,后續(xù)實驗我們選用1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml劑量組Dio處理TNF-α誘導的RAFLS,作用24h。
  3.與對照組相比,RAFLS經TNF-α誘導后,培養(yǎng)上清中LTB4含量明顯升高,Dio能劑量依賴的降低TNF-α引起的LTB4含量的升高(P<0.05)。
  4.與對照組相比,RAFLS經T

11、NF-α誘導后,細胞中5-LO和LTA4H mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與TNF-α模型組相比,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml Dio劑量組細胞5-LO和LTA4H mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)。
  5.與對照組相比,RAFLS經TNF-α誘導后,細胞中BLT1和BLT2 mRNA表達明顯升高,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml劑量組Dio能顯著降低TNF-α模型細胞中

12、BLT1和BLT2 mRNA表達,4μg/ml劑量組Dio能顯著降低FLS中BLT2 mRNA表達(P<0.05)。
  結論:
  1.10ng/ml TNF-α與RAFLS共同孵育24h,可以顯著促進RAFLS的增殖,故選擇此濃度作用24小時制作離體RA疾病模型。
  2.1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml的Dio與TNF-α誘導的RAFLS共同孵育24h,能顯著抑制RAFLS細胞的增殖,提示其

13、對TNF-α引起的RAFLS損傷具有保護作用。
  3.Dio可以降低TNF-α誘導的RAFLS培養(yǎng)上清中LTB4的含量,這可能與其對FLS損傷的保護作用有關。
  4.Dio可能通過下調TNF-α誘導的RAFLS中LTB4合成酶系5-LO和LTA4H表達,降低上清中LTB4的含量。
  5.Dio可以降低TNF-α誘導的RAFLS LTB4受體BLT1和BLT2的表達,阻礙LTB4下游通路,發(fā)揮對TNF-α誘導的RA

14、FLS損傷的治療作用。
  第二部分薯蕷皂苷經5-LO/LTB4途徑治療CIA小鼠的作用及機制
  研究背景和目的:
  RA是一種以關節(jié)滑膜炎為主要特征的常見的自身免疫病。臨床患者表現為關節(jié)晨僵、腫脹、畸形,甚至功能喪失、殘疾等,嚴重影響患者的生活質量。CIA模型是與RA臨床發(fā)病最為相似的動物模型,是RA實驗研究的常用動物模型。中醫(yī)學認為薯蕷皂苷具有“消食利水,舒筋活血,祛痰,截瘧”的功效,現代研究證實薯蕷皂苷具有調

15、節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、改善心血管功等多種藥理作用,是一種潛在的治療RA的中藥。本實驗擬應用牛Ⅱ型膠原誘導的CIA小鼠模型,從整體動物水平研究薯蕷皂苷片(Dioscornin tablets,DT)對RA的治療作用,并探討其分子機制。
  方法:
  1.雄性昆明系小鼠(6-8周齡),體重25±2g,隨機分為對照組、CIA小鼠模型組和DT5個劑量組:15.6 mg/(kg·d)、31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(

16、kg·d)、124.8mg/(kg·d)、249.6 mg/(kg·d),每組12只。于初次免疫d21,對照組和模型組給予生理鹽水灌胃,用藥組給予不同劑量的DT灌胃,觀察DT對CIA模型小鼠體重、關節(jié)指數、足爪腫脹程度、胸腺和脾臟指數、脾臟和滑膜病理損傷的影響。
  2.ELISA檢測對照組,CIA模型組,低、中、高DT組小鼠血清中LTB4含量變化。
  3.反轉錄PCR(RT-PCR)檢測對照組,CIA模型組,低、中、高D

17、T組小鼠脾臟中5-LO、LTA4H、BLT1、BLT2 mRNA表達的變化。
  4.蛋白印跡和免疫組化檢測對照組,CIA模型組,低、中、高DT組小鼠脾臟中5-LO、LTA4H蛋白的表達變化。
  結果:
  1.與對照組相比,CIA模型組小鼠體重、關節(jié)指數、關節(jié)腫脹度以及胸腺指數和脾臟指數明顯高于對照組(P<0.05)。與CIA模型組相比,灌胃治療12天后31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、1

18、24.8mg/(kg·d)DT劑量組小鼠體重、關節(jié)指數和關節(jié)腫脹度有不同程度的降低,灌胃治療21天后小鼠的脾臟指數均不同程度的降低(P<0.05)。灌胃治療21天后62.4 mg/(kg·d)各DT劑量組小鼠胸腺指數顯著降低(P<0.05),脾臟病理損傷和踝關節(jié)病理損傷明顯改善。
  2.與對照組相比,CIA模型組小鼠血清中LTB4的含量明顯升高,而不同劑量組DT均能顯著的降低CIA小鼠血清中LTB4含量(P<0.05)。

19、  3.與對照組相比,CIA模型組小鼠脾臟中LTA4H和5-LO mRNA和蛋白的表達明顯升高(P<0.05),而DT低、中、高組劑量均能顯著的降低CIA小鼠脾臟中5-LO和LTA4H蛋白的表達,DT低、中組劑量能顯著的降低CIA小鼠脾臟中5-LO mRNA的表達(P<0.05)。
  4.與對照組相比,CIA模型組小鼠脾臟中BLT1和BLT2 mRNA表達明顯升高,DT低、中組劑量能顯著的降低CIA小鼠脾臟中BLT1 mRNA表

20、達,低、中、高劑量DT均能顯著降低CIA小鼠脾臟中BLT2 mRNA表達(P<0.05)。
  結論:
  1.31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)劑量組DT可明顯降低CIA小鼠體重、關節(jié)指數、關節(jié)腫脹度以及胸腺指數、脾臟指數,并且可明顯改善小鼠胸腺和脾臟病理損傷,因此對CIA小鼠有治療作用。
  2.CIA模型組小鼠血清中LTB4的含量明顯升高,不同劑量組DT均可顯

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