裂果薯總皂苷抗肝癌作用與裂果薯皂苷SSPH通過ROS-Erk通路抑制Hela細胞的作用機制研究.pdf

1、目的：1.裂果薯總皂苷(SFSP)抗肝癌作用初探；2.裂果薯皂苷單體1(SSPH)對腫瘤細胞作用機制研究。
　　方法：SFSP對人肝癌細胞SMMC-7721與Bel-7404的細胞增殖與集落形成的抑制作用通過MTT實驗測定。使用免疫熒光法觀察SFSP對SMMC-7721細胞形態(tài)影響與VEGF表達的影響。使用MTT法測定SFSP對其他抗腫瘤藥物作用的影響。以家兔紅細胞溶血實驗與小鼠急性毒性試驗驗證SFSP的安全性，并測定SFSP對人

2、原代肝細胞HL-7702的抑制作用。使用Hochest33258染色觀察裂果薯對細胞核染色體形態(tài)的改變。SMMC-7721與Bel-7404的凋亡與細胞周期阻滯情況以流式細胞儀通過PE/7-AAD染色法檢測，SMMC-7721與Bel-7404細胞中活性氧的水平也以流式細胞儀檢測，Caspase-3，-8與-9的激活情況使用ELISA法測定。我們使用Western blot檢測SFSP對MAPK信號通路的表達與磷酸化情況，并以相關(guān)通路阻

3、斷劑與激活劑驗證其效果。SFSP的體內(nèi)抗腫瘤作用以人肝癌細胞SMMC-7721裸鼠移植瘤模型驗證，免疫組化法觀察移植瘤內(nèi)相關(guān)蛋白的表達情況并與體外實驗相互印證。SSPH對Hela細胞的抑制作用由Neutral Red法與WST-8法檢測。熒光素酶法初步檢測SSPH對Hela細胞腫瘤相關(guān)通路的影響。qRT-PCR法測定SSPH對Hela細胞腫瘤通路相關(guān)基因表達的影響，并以各通路抑制劑驗證SSPH可能的作用通路。SSPH對Hela細胞的凋亡

4、誘導(dǎo)作用由流式細胞儀使用Annexin V/PI染色法檢測，凋亡相關(guān)蛋白的表達由WB檢測。SSPH對MAPK信號通路的激活作用以細胞內(nèi)WB法測定。SSPH對ROS的影響由流式細胞儀檢測并與NAC聯(lián)用驗證。SSPH對MAPK信號通路的表達與磷酸化的影響由WB測定并與NAC聯(lián)用驗證。
　　結(jié)果：SFSP顯著抑制SMMC-7721與Bel-7404的增殖，其24h的IC50為3.75與3.93μg/ml，SFSP對這兩種細胞的集落形成能

5、力也有顯著抑制作用，其最高抑制率為83.37與89.02％。免疫熒光觀察顯示SFSP使SMMC-7721細胞微管蛋白形態(tài)異常且VEGF的表達降低。SFSP對阿霉素與柔紅霉素的體外抗腫瘤作用沒有明顯影響，但顯著降低紫杉醇對SMMC-7721細胞的抑制作用。SFSP對HL-7702細胞的IC50為47.6μg/ml，顯著高于SFSP對兩種肝癌細胞的IC50值。SFSP對家兔紅細胞的溶血濃度為60.2μg/ml，對小鼠急性毒性實驗顯示SFSP

6、在5000mg/kg/day無毒性反應(yīng)，顯著低于裂果薯醇提物4520mg/kg/D的LD50劑量，證明SFSP是一種安全性良好的藥物。Hochest33258染色觀察提示SFSP可能對SMMC-7721有凋亡誘導(dǎo)作用。PE/7-AAD染色觀察驗證了這一觀察結(jié)果，SFSP在2、5和10μg/ml劑量下造成40.23%，42,30%和46.83%的SMMC-7721細胞凋亡，在同樣劑量下造成14.50%，33.97%與46.77%的Bel-

7、7404細胞凋亡。SFSP也使這兩種細胞阻滯于G2/M期中，SFSP10μg/ml將31.3%的SMMC-7721細胞或32.5%的Bel-7404細胞阻滯于G2/M期，而空白組處于G2/M期的細胞僅為18.8%與16.6%。Caspase活性檢測發(fā)現(xiàn)SFSP能激活SMMC-7721與Bel-7404細胞中Caspase-3，-8與-9，同時SFSP還能提升SMMC-7721細胞內(nèi)ROS的含量。WB結(jié)果顯示，SFSP能夠在不影響JNK，

8、Erk與p38的表達的情況下提升JNK與Erk的磷酸化水平，并且降低p38的磷酸化水平。JNK，Erk特殊抑制劑能夠阻斷SFSP對JNK與Erk信號通路的激活作用，p38特殊激動劑能夠阻斷SFSP對p38的抑制作用，但僅有Erk與JNK的阻斷影響SFSP的細胞毒性作用。SFSP能夠顯著的抑制裸鼠腫瘤的重量與體積。高劑量組（50mg/kg/day）（p<0.01），中劑量組（25mg/kg/day）（p<0.05）與陽性藥物組（15mg/

9、kg/day）（p<0.01）均對裸鼠的腫瘤體積與重量有顯著抑制作用，其中高劑量組的抑制率為65.20%，免疫組化法驗證SFSP在瘤組織內(nèi)也可激動Erk與JNK信號通路并抑制p38信號通路，提示SFSP在體內(nèi)與體外對MAPK信號通路有相似的調(diào)控作用。Neutral Red實驗與WST-8實驗證明SSPH對Hela細胞的增殖有著顯著的抑制作用，其IC50為4.13μM。SSPH對Stat3，Smad，NF-κB，E2F，Myc，Ets與W

10、nt P具有顯著抑制作用。qRT-PCR結(jié)果顯示SSPH可在一定時間點將A20，AXIN2，BCL2，CCND1，PYGO2和TERT基因激活至2.53,2.50,2.15,2.14,2.05與3.00倍。進一步與各通路抑制劑聯(lián)用的結(jié)果顯示SSPH可能對MEK信號通路，NF-κB信號通路以及PI3K信號通路具有調(diào)控作用。細胞內(nèi)WB的結(jié)果證實SSPH對MEK具有激活作用，p-Erk在經(jīng)歷15min時的短暫下降之后，磷酸化程度持續(xù)增強，而p

11、-JNK與p-p38的表達并未出現(xiàn)明顯變化。SSPH作用24h后顯著誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，并存在劑量依賴性。SSPH12μM作用下，Hela細胞出現(xiàn)凋亡（p<0.01），其早期凋亡率為10.62%，晚期凋亡與壞死率為38.14%。6μM SSPH在作用24 h后顯著提升細胞內(nèi)ROS的含量，Hela細胞內(nèi)ROS增加30%。NAC可以阻斷SSPH造成的ROS提升，10mM NAC預(yù)處理Hela細胞1h后與6μM SSPH共同作用，ROS增加

12、量減少20%。SSPH持續(xù)提升Hela細胞內(nèi)Erk1/2的磷酸化水平，但是當(dāng)SSPH與NAC協(xié)同作用時，Erk1/2磷酸化水平顯著低于SSPH單獨作用組。SSPH與NAC對JNK與p38信號通路沒有作用，WB結(jié)果顯示各個時間點JNK與p38的表達量與磷酸化程度均無改變。WST-8測定SSPH聯(lián)合NAC與UO126的細胞毒性結(jié)果顯示，NAC與UO126均降低SSPH的細胞毒性作用。SSPH增加c-PARP，減少Caspase3與PARP，