葉綠體PSⅡ中D1前體蛋白C-末端尾巴功能分析.pdf

1、植物通過光合作用利用太陽能將水和CO2等無機(jī)物合成有機(jī)物并釋放出氧氣，為整個(gè)生物圈的生命生存和發(fā)展提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。植物葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要場所，PSⅡ作為葉綠體中最基本的光合系統(tǒng)復(fù)合體，它的正確組裝和及時(shí)修復(fù)是葉綠體維持其功能的前提。而由葉綠體psbA基因編碼的D1蛋白是PSⅡ反應(yīng)中心的核心蛋白，高的植物的D1蛋白前體具有一個(gè)C末端尾巴，通過蛋白酶CtpA切除C末端尾巴使其成熟，促使PSⅡ功能正常發(fā)揮。而在一些低等生物中沒有C

2、末端尾巴，無需CtpA的參與，D1蛋白合成后就已成熟。目前對于高等植物中D1蛋白的成熟機(jī)制以及碳末端尾巴的功能還不了解。
　　針對這些有待闡明的問題，本研究以煙草為材料，構(gòu)建嵌合無尾或雙尾的D1編碼基因的煙草葉綠體表達(dá)載體，通過基因槍轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化，通過抗生素加壓篩選來獲得D1尾巴缺失或加倍的突變體植株;此外，以GFP為報(bào)告基因，以擬南芥的rbcS基因的前導(dǎo)序列作為葉綠體導(dǎo)肽序列，構(gòu)建嵌合無尾或雙尾的D1編碼基因的雙元植物表

3、達(dá)載體，進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)，檢測葉綠體導(dǎo)肽的有效性，進(jìn)一步通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得穩(wěn)定表達(dá)的D1突變體植株，為后續(xù)表型分析奠定基礎(chǔ);最后，構(gòu)建含不同C末端尾巴的D1蛋白原核表達(dá)載體，體外表達(dá)外源蛋白，進(jìn)而進(jìn)行蛋白酶CtpA的酶切驗(yàn)證和分析。
　　本研究取得如下研究結(jié)果:
　　在煙草中，通過常規(guī)的載體構(gòu)建技術(shù)，以壯觀霉素aadA為篩選標(biāo)記，以GFP為報(bào)告基因，經(jīng)過多重酶切檢測以及測序，獲得了六個(gè)符合預(yù)期設(shè)計(jì)的煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體

4、。并將六個(gè)質(zhì)粒載體制作成微彈，利用基因槍法進(jìn)行煙草葉綠體轉(zhuǎn)化，在壯觀霉素篩選培養(yǎng)基中均獲得了煙草抗性苗。設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行鑒定，經(jīng)PCR驗(yàn)證目的基因已整合進(jìn)煙草葉綠體基因組中。
　　構(gòu)建含GFP的雙元植物表達(dá)載體，在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光，證實(shí)葉綠體導(dǎo)肽有效。使用雙元植物表達(dá)載體，在擬南芥突變體中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)草銨膦篩選及DNA水平的檢測獲得了表型不完全恢復(fù)的轉(zhuǎn)基因突變體植株，并對擬南芥