亮氨酸應(yīng)答調(diào)控因子Lrp調(diào)控抗生素生物合成的分子機制及應(yīng)用.pdf

1、Lrp(Leucine-responsive regulatory protein)家族，又被稱為Lrp/AsnC家族，是一類廣泛存在于原核生物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠參與調(diào)控細(xì)胞的多個生理過程，包括氨基酸的代謝、胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、DNA的修飾與重組、細(xì)菌抗性等多個方面。然而目前在產(chǎn)抗生素的放線菌中關(guān)于Lrp蛋白調(diào)控抗生素生物合成的研究非常少，具體的調(diào)控機制更是有待深入的探究。紅霉素(Erythromycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由放

2、線菌(Actinomycete)中糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)次生代謝產(chǎn)生，對于多種致病菌都具有較強大的抗菌活性。根據(jù)生物信息學(xué)分析，糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp(SACE_5388)基因編碼一種Lrp家族的同源蛋白，與已報道的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中Lrp同源性高達(dá)56％，并且它們轉(zhuǎn)錄方向相反的鄰近基因都是編碼分支氨基酸ABC轉(zhuǎn)運蛋白。本研究主

3、要內(nèi)容包括：
　　⑴利用大腸桿菌體外表達(dá)技術(shù)得到可溶性的SACE_Lrp蛋白，通過蛋白與DNA結(jié)合的EMSA實驗證實了SACE_Lrp對鄰近的SACE_5387-5386具有直接的調(diào)控作用。為了探究SACE_Lrp在糖多孢紅霉菌中的功能，我們通過大片段敲除技術(shù)在糖多孢紅霉菌A226中構(gòu)建了SACE_Lrp缺失突變株。高效液相色譜分析表明，與出發(fā)菌株A226相比，SACE_Lrp缺失突變株（ΔSACE_Lrp）中紅霉素產(chǎn)量提高了25

4、％，而SACE_Lrp基因回補后，紅霉素的產(chǎn)量回復(fù)到出發(fā)菌株的水平，同時在A226中對SACE_Lrp過表達(dá)后紅霉素產(chǎn)量相比出發(fā)菌株下降23％，說明SACE_Lrp對紅霉素生物合成具有負(fù)調(diào)控作用。SACE_Lrp的缺失對糖多孢紅霉菌的菌體生長和形態(tài)分化并無明顯的影響。進一步的qRT-PCR分析顯示，SACE_Lrp缺失突變株中紅霉素生物合成基因簇中基因eryAI和ermE、鄰近的分支氨基酸ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因SACE_5387-5386以

5、及分支氨基酸代謝路徑中氨基轉(zhuǎn)移酶基因ilvE的轉(zhuǎn)錄水平都有顯著升高，表明SACE_Lrp很可能通過調(diào)節(jié)紅霉素結(jié)構(gòu)基因、鄰近分支氨基酸轉(zhuǎn)運基因以及分支氨基酸代謝基因轉(zhuǎn)錄水平最終影響紅霉素的產(chǎn)生。利用氨基酸自動分析儀對A226與ΔSACE_Lrp的胞內(nèi)外游離氨基酸分析結(jié)果表明，ΔSACE_Lrp中胞外三種分支氨基酸(Val、Ile和Leu)的含量低于A226，而ΔSACE_Lrp胞內(nèi)三種分支氨基酸的含量也低于A226，說明SACE_Lrp的

6、缺失不僅影響分支氨基酸從胞外轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，還影響了胞內(nèi)分支氨基酸的代謝轉(zhuǎn)化，從而影響紅霉素生物合成的前體供應(yīng)。我們在糖多孢紅霉菌A226中過量表達(dá)SACE_5387-5386，紅霉素產(chǎn)量提高了31％。進一步在糖多孢紅霉菌A226的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加分支氨基酸后，紅霉素的產(chǎn)量相應(yīng)提高47％(Val)、35％(Ile)和16％(Leu)。
　?、评肈Nase I footprinting技術(shù)解析了糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp的保守

7、結(jié)合位點為一段富含GC的DNA序列:CCTCCGGGCAACATTC，并通過缺失突變進行了驗證。根據(jù)保守結(jié)合位點的分布位置，推測SACE_Lrp不僅調(diào)控鄰近的轉(zhuǎn)錄方向相反的SACE_5387-5386，還可能具有自我調(diào)控的作用，本研究通過設(shè)計體內(nèi)的GFP報告系統(tǒng)證實，SACE_Lrp對自身的轉(zhuǎn)錄存在轉(zhuǎn)錄抑制。Lrp家族的一大特征是C末端結(jié)構(gòu)域具有響應(yīng)配體氨基酸的能力，通過在體外EMSA體系中添加20種蛋白質(zhì)氨基酸，發(fā)現(xiàn)添加Lys和Arg

8、可以抑制SACE_Lrp與靶DNA的結(jié)合，而添加His可以促進蛋白與靶DNA的結(jié)合，說明SACE_Lrp具有雙向響應(yīng)的氨基酸配體，Lys和Arg是抑制型配體，His是促進型配體。進一步通過設(shè)計體內(nèi)GFP報告系統(tǒng)，證實了SACE_Lrp在體內(nèi)情況下同樣可以對三種配體氨基酸進行應(yīng)答。目前為止，糖多孢紅霉菌SACE_Lrp是Lrp家族蛋白中首次被解析雙向響應(yīng)配體的成員。糖多孢紅霉菌低產(chǎn)菌株A226中，SACE_Lrp的缺失、增加SACE_Lr

9、p靶基因SACE_5387-5386的拷貝數(shù)，以及添加SACE_Lrp調(diào)控底物分支氨基酸三種策略在提高紅霉素產(chǎn)量方面都取得了良好的效果。我們將這三種策略應(yīng)用于紅霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株WB。高效液相色譜分析表明，WB中缺失SACE_Lrp基因（WBΔSACE_Lrp）后，突變株紅霉素產(chǎn)量提高19％;在缺失SACE_Lrp基因的基礎(chǔ)上過量表達(dá)SACE_5387-5386（WBΔSACE_Lrp/5387-5386），紅霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株WB提高4

10、1％;在工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)中額外添加10 mM Val，WBΔSACE_Lrp/5387-5386的紅霉素產(chǎn)量較WB提高48％，最終在5-L發(fā)酵罐水平上，紅霉素的產(chǎn)量由3503 mg/L顯著提高41％，達(dá)到5001mg/L。說明在紅霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株中，以SACE_Lrp調(diào)控元件為基礎(chǔ)的改造確實可以顯著的提高紅霉素的產(chǎn)量，這一調(diào)控元件的開發(fā)和應(yīng)用為未來其他工業(yè)高產(chǎn)菌株的改造和篩選提供了基礎(chǔ)。
　?、歉鶕?jù)同源性分析比對，SACE_Lrp的同

11、源蛋白廣泛存在于其他產(chǎn)抗生素的放線菌中，為了研究Lrp蛋白對于抗生素生物合成的調(diào)控功能是否具有普適性，我們選擇模式鏈霉菌-天藍(lán)色鏈霉菌作為代表。通過在天藍(lán)色鏈霉菌M145中缺失SACE_Lrp同源蛋白基因SCO3361，構(gòu)建缺失突變株ΔSCO3361，并對次級代謝產(chǎn)物進行分析發(fā)現(xiàn)，SCO3361缺失突變后，放線紫紅素(Act)的產(chǎn)量急劇下降至出發(fā)菌株的20％水平，而十一烷基靈菌紅素(Red)和鈣依賴抗生素(CDA)的產(chǎn)量并無顯著變化。S

12、CO3361缺失突變后，菌株的產(chǎn)孢能力也明顯下降，說明SCO3361不僅調(diào)控天藍(lán)色鏈霉菌的次級代謝，還調(diào)控菌株的形態(tài)分化。這些結(jié)果說明在產(chǎn)抗生素的放線菌中，Lrp同源蛋白對于抗生物生物合成的調(diào)控作用是很可能普遍存在的。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，SCO3361缺失突變株中Act生物合成基因簇的簇內(nèi)調(diào)控蛋白基因actⅡ-ORF4(SCO5085)和產(chǎn)孢相關(guān)蛋白基因amfC(SCO4184)、whiB(SCO3034)、ssgB(SCO15

13、14)的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，說明SCO3361對Act的生物合成和菌株的孢子形成具有顯著的正調(diào)控作用;ΔSCO3361突變株中，自身基因表達(dá)量顯著升高，證實SCO3361同樣具有抑制自身轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。EMSA實驗證實，SCO3361能夠結(jié)合actⅡ-ORF4的啟動子，說明SCO3361能夠直接調(diào)控Act的生物合成基因簇。通過qRT-PCR分析結(jié)合EMSA實驗發(fā)現(xiàn)SCO3361也同樣可以直接調(diào)控鄰近的轉(zhuǎn)錄方向相反的SCO3362。利用體外

14、EMSA和體內(nèi)GFP報告系統(tǒng)，解析Phe是SCO3361的抑制型配體，Cys是SCO3361的促進型配體。EMSA實驗證實SACE_Lrp能夠與SCO3361的靶DNA結(jié)合，而SCO3361也能夠與SACE_Lrp的靶DNA結(jié)合，二者存在交叉調(diào)控的作用。我們的研究結(jié)果說明天藍(lán)色鏈霉菌中Lrp同源蛋白SCO3361不僅可以調(diào)控特定抗生素的生物合成，還調(diào)控了天藍(lán)色鏈霉菌的形態(tài)分化，說明Lrp家族蛋白在其他產(chǎn)抗生素的放線菌中同樣可以調(diào)控抗生素