ERK調(diào)控絨山羊細(xì)胞生長(zhǎng)及感受亮氨酸信號(hào)的分子機(jī)制研究.pdf

1、ERK(extracellular regulated protein)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的有絲分裂原活化蛋白激酶，是mTOR信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子。ERK/mTOR信號(hào)通路可以匯聚和整合來(lái)自于營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、能量和環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞的刺激信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。目前ERK/mTOR信號(hào)通路在人和其他模式生物中有了較為深入的研究，但在山羊細(xì)胞中的研究尚屬空白。
　　 內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育而形成的地方

2、性品種，對(duì)氨基酸的利用與代謝有其特殊性。亮氨酸(Leu)是動(dòng)物體內(nèi)唯一的生酮氨基酸，是支鏈氨基酸中對(duì)蛋白質(zhì)代謝起主要調(diào)節(jié)作用的氨基酸，可以激活mTORC1，促進(jìn)p70S6K的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。本研究旨在探討內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中ERK調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和感受Leu信號(hào)的分子機(jī)制，力圖實(shí)現(xiàn)對(duì)ERK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)氨基酸信號(hào)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的初步認(rèn)識(shí)。
　　 實(shí)驗(yàn)研究分為兩個(gè)階段，首先利用MEK特異性抑制劑U012

3、6處理細(xì)胞，抑制ERK1/2活性，觀察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，證明ERK信號(hào)通路對(duì)絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)具有調(diào)控作用；之后采用抑制劑和Leu組合處理的方法，探討ERK/mTOR/p70S6K信號(hào)通路感受氨基酸刺激的機(jī)制。第一階段分別運(yùn)用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制抑制率曲線及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)U0126對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。第二階段首先檢測(cè)Leu刺激細(xì)胞后，ERK1/2的蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平，再運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè)ERK和p7

4、0S6K的相互作用關(guān)系。
　　 結(jié)果表明，U0126對(duì)內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有著明顯的抑制作用，IC50為1.52μM。同時(shí)，U0126對(duì)mTOR的下游效應(yīng)器p70S6K、S6、4EBP1的磷酸化水平都有明顯的抑制作用。用Leu刺激細(xì)胞，ERK1/2(T202/Y204)的磷酸化水平有了明顯的提高；當(dāng)使用U0126阻斷MEK/ERK通路后，發(fā)現(xiàn)Leu仍然可以提高ERK1/2的磷酸化水平。預(yù)示著ERK感受Leu信號(hào)刺激

5、可能不依賴于MEK/ERK信號(hào)通路。
　　 為了探討Leu信號(hào)激活ERK1/2的可能機(jī)制，我們以ERK1/2抗體為誘餌抗體做免疫共沉淀并進(jìn)行westernblot鑒定，表明ERK1/2和p70S6K可以形成復(fù)合物，存在著直接或間接的相互作用關(guān)系。進(jìn)一步的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明ERK2和p70S6K并不存在直接的相互作用，但不能排除ERK1和p70S6K可以發(fā)生直接的相互作用或ERK1/2與p70S6K之間存在間接的相互作用關(guān)系的可能