活性氧誘導(dǎo)生物活性分子自由基的自旋標(biāo)記熒光法表征.pdf

1、生物活性分子自由基的研究具有重要意義，通過(guò)對(duì)其產(chǎn)生位點(diǎn)、壽命、反應(yīng)活性、修復(fù)等機(jī)理的研究，能夠進(jìn)一步增加對(duì)生物分子的活性氧自由基損傷機(jī)理的認(rèn)識(shí)。生物活性分子自由基具有低濃度，短壽命以及高自聚反應(yīng)活性等特點(diǎn)，已建立的一些分析方法，如電子自旋共振法、免疫-自旋捕集法和質(zhì)譜法，還不能夠滿(mǎn)足對(duì)生物活性分子自由基進(jìn)行原位、適時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)的要求。熒光表征技術(shù)具有表征參數(shù)多，動(dòng)態(tài)范圍寬，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，尤其是已發(fā)展成熟的熒光顯微技術(shù)，為原位

2、、實(shí)時(shí)研究在細(xì)胞中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)工程提供了有效的手段。然而，熒光分析技術(shù)在應(yīng)用于生物活性自由基的研究時(shí)，尚缺乏靈敏、特效的自由基熒光探針。本論文的研究目標(biāo)在于開(kāi)發(fā)生物活性自由基的熒光探針，并研究其在表征生物活性自由基方面的應(yīng)用。論文共分七章，包括前言、實(shí)驗(yàn)材料與方法、肽碳中心自由基的熒光表征、肽硫中心自由基的熒光表征、肌紅蛋白自由基的熒光表征、血紅蛋白自由基的熒光表征，核苷酸自由基的熒光表征。 第一章，前言，綜述了近年來(lái)生物活性

3、分子自由基分析表征研究的進(jìn)展。綜述以活性氧誘導(dǎo)生物活性分子的氧化損傷，包括蛋白質(zhì)的氧化損傷、DNA的氧化損傷以及脂質(zhì)過(guò)氧化為切入點(diǎn)，介紹了生物活性自由基分析表征研究的重要意義。進(jìn)而闡述了生物活性分子自由基的分析表征研究的現(xiàn)狀，介紹了生物活性自由基分析表征的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括電子自旋捕集法、免疫自旋捕集法以及質(zhì)譜法。最后，在此基礎(chǔ)上提出了論文的研究設(shè)想。 第二章，實(shí)驗(yàn)材料與方法，介紹了論文研究工作中所涉及的儀器與試劑，介紹了自旋標(biāo)記熒

4、光探針(萘-氮氧自由基復(fù)合分子NA-Tempo·和丫啶-氮氧自由基復(fù)合分子Ac-Tenpo·)的合成與表征，以及生物樣品的制備。 第三章，肽碳中心自由基的熒光表征，介紹了應(yīng)用自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·表征肽碳中心自由基的研究。Ac-Tempo·為弱熒光物質(zhì)，當(dāng)其捕集辣根過(guò)氧化物酶催化H2O2氧化酪氨酸衍生物產(chǎn)生的碳中心自由基后，熒光性質(zhì)顯著變化，為應(yīng)用熒光參量表征酪氨酸自由基提供了基礎(chǔ)。論文對(duì)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件和熒光表征的機(jī)

5、理進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對(duì)熒光產(chǎn)物進(jìn)行了分析認(rèn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的不同，自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·或與肽碳中心自由基反應(yīng)生成熒光物質(zhì)4-(9-丫啶酯)-2,2,6,6-四甲基哌啶(Ac-piperidine)，或直接捕集肽碳中心自由基生成熒光加合物。研究表明Ac-piperidine的形成主要源自酪氨酸自由基自身的共振結(jié)構(gòu)，以及水中溶解氧的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。增加自旋標(biāo)記熒光探針的濃度或降低體系中溶解氧的濃度均可以促進(jìn)加合物的生

6、成，加合物的形成將為研究自由基的形成位點(diǎn)和自由基的結(jié)構(gòu)提供了有效的手段。相對(duì)于酪氨酸衍生物自由基，Ac-Tempo·對(duì)色氨酸衍生物產(chǎn)生的自由基的捕集效率較低，表明自旋標(biāo)記熒光探針對(duì)自由基的捕集受到空間位阻的影響。 第四章，肽硫中心自由基的熒光表征，介紹了應(yīng)用自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·表征肽硫中心自由基的研究。非熒光自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·捕集過(guò)氧亞硝酸以及Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH氧化谷胱甘肽產(chǎn)生的硫中心自由

7、基后，熒光強(qiáng)度顯著增加，為表征硫中心自由基提供了基礎(chǔ)。論文對(duì)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件和熒光表征的機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。經(jīng)HPLC-MS分析，表明Ac-Tempo·捕集由過(guò)氧亞硝酸誘導(dǎo)谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，生成熒光物質(zhì)Ac-piperidine，Ac-Tempo·捕集由Fenton反應(yīng)誘導(dǎo)谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，產(chǎn)生的熒光物質(zhì)為Ac-piperidine和4-(9-丫啶酯)-2，2，-二甲基吡咯(Ac-pyrrolidine)。A

8、c-piperidine的形成源自Ac-Tempo·與硫中心自由基反應(yīng)后形成不穩(wěn)定的N-O-S鍵的斷裂。Ac-pyrrolidine的形成可能源自在GSH存在下Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的Fe3+的作用。氮氧自由基為重要的自由基清除劑，研究其捕集自由基及代謝機(jī)理，對(duì)其應(yīng)用具有重要意義。本章實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于不同來(lái)源的活性氧自由基，氮氧自由基與其反應(yīng)后的產(chǎn)物不完全相同，這一結(jié)果為理解氮氧自由基的代謝機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，豐富了氮氧自由基代謝的理

9、論。 第五章，肌紅蛋白自由基的熒光表征，介紹了應(yīng)用自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·表征肌紅蛋白自由基的研究。本章的研究工作是以肌紅蛋白以及心臟組織勻漿液作為蛋白質(zhì)模型，通過(guò)Ac-Tempo·對(duì)H2O2氧化其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)自由基進(jìn)行表征。當(dāng)Ac-Tempo·捕集H2O2氧化肌紅蛋白產(chǎn)生的蛋白質(zhì)自由基后，熒光強(qiáng)度顯著增加，從而可對(duì)其進(jìn)行表征。論文對(duì)表征的實(shí)驗(yàn)條件和機(jī)理進(jìn)行了研究，在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，Ac-Tempo·對(duì)肌紅蛋白的最

10、低響應(yīng)量為6.8×10-6g/mL，對(duì)心臟組織勻漿液的最低響應(yīng)量為1.3×10-5g/mL。經(jīng)HPLC-MS分析，確定形成的熒光物質(zhì)為Ac-piperidine。Ac-piperidine的形成也主要源自于蛋白質(zhì)自由基自身的共振結(jié)構(gòu)，以及溶液中O2分子的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。 第六章，血紅蛋白自由基的熒光表征，介紹了應(yīng)用自旋標(biāo)記熒光探針Ac-Tempo·表征血紅蛋白自由基的研究結(jié)果。本章的研究工作是以血紅蛋白以及紅細(xì)胞裂解液作為蛋白質(zhì)模型，

11、通過(guò)Ac-Tempo·對(duì)H2O2氧化其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)自由基進(jìn)行表征。非熒光物質(zhì)Ac-Tempo·捕集H2O2氧化血紅蛋白產(chǎn)生的蛋白質(zhì)自由基，形成強(qiáng)熒光產(chǎn)物，達(dá)到對(duì)目標(biāo)自由基表征的目的。論文對(duì)表征的實(shí)驗(yàn)條件和機(jī)理進(jìn)行了研究，在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，Ac-Tempo·對(duì)血紅蛋白的最低響應(yīng)量為8.4×10-7g/mL，對(duì)紅細(xì)胞裂解液的最低響應(yīng)量為1.6×10-6g/mL。MS-MS分析結(jié)果表明，形成的熒光物質(zhì)為Ac-piperidine。在前期研

12、究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)研究計(jì)劃，進(jìn)一步對(duì)自旋標(biāo)記熒光探針應(yīng)用于熒光顯微技術(shù)，表征細(xì)胞中的蛋白質(zhì)自由基進(jìn)行了初步的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未達(dá)到預(yù)期的效果。我們推測(cè)原因可能為紅細(xì)胞中血紅蛋白的含量(ng級(jí))低于該方法對(duì)血紅蛋白的最低響應(yīng)量。該方法的靈敏度受到所使用的自旋標(biāo)記熒光探針濃度的影響，若增加探針的水溶性，則應(yīng)該能夠提高該方法的靈敏度。這為該課題后續(xù)研究工作的思路提出了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第七章，核苷酸自由基熒光表征，介紹了應(yīng)用自旋標(biāo)記熒