7--酮基膽甾醇壬二酸單酯對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控作用.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因。由氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein， oxLDL）驅(qū)動(dòng)的巨噬細(xì)胞泡沫化在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究顯示，清道夫受體CD36及血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)密切參與并調(diào)控了巨噬

2、細(xì)胞泡沫化的形成，因此研究二者與oxLDL的相互作用關(guān)系，并闡明該作用對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程的調(diào)控機(jī)制，對(duì)預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化具有重要的意義。在前期研究中，從oxLDL脂類提取物中分離得到一種新型表位結(jié)構(gòu)—7-酮基膽甾醇壬二酸單酯（7-ketocholesteryl carboxynonanoate，oxLig-1），并推測(cè)oxLig-1很可能介導(dǎo)了oxLDL與清道夫受體CD36、LOX-1的結(jié)合作用，從而調(diào)控了巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取及

3、轉(zhuǎn)運(yùn)過程。為了進(jìn)一步明確oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化形成的作用機(jī)制，本論文以oxLig-1、CD36及LOX-1為研究對(duì)象，主要從以下幾個(gè)方面展開了研究。
　　首先通過分子對(duì)接模擬、酶聯(lián)免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)以及表面等離子體共振技術(shù)(Surface plasmon resonance，SPR)分別對(duì)oxLig-1與CD36、LOX-1的結(jié)合作用加以研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)o

4、xLig-1作為表位結(jié)構(gòu)介導(dǎo)了oxLDL與清道夫受體CD36、LOX-1的結(jié)合作用，并且該結(jié)合作用表現(xiàn)出高度的結(jié)合親和性。隨后分別對(duì)oxLig-1的各亞結(jié)構(gòu)組份以及甲基化修飾物進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，oxLig-1的疏水核心結(jié)構(gòu)為結(jié)合作用提供了疏水作用，而ω-COOH則是結(jié)合過程中的主要位點(diǎn)，為結(jié)合構(gòu)象的穩(wěn)定和結(jié)合作用的加固發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　其次借助慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)分別構(gòu)建得到CD36及LOX-1穩(wěn)轉(zhuǎn)基因沉默巨噬細(xì)胞株，并以此

5、為模型在細(xì)胞水平驗(yàn)證了oxLig-1與CD36、LOX-1的結(jié)合作用。隨后利用基因沉默細(xì)胞模型以及激光共聚焦技術(shù)分析了CD36介導(dǎo)oxLDL吞噬的具體機(jī)制。結(jié)果顯示，oxLig-1可在細(xì)胞膜表面同CD36以及Caveolin-1發(fā)生共定位，同時(shí)oxLig-1及oxLDL的刺激作用可誘導(dǎo)Caveolin-1發(fā)生膜向移位以及聚集。與之相比oxLig-1的甲基化修飾物(me-oxLig-1)未表現(xiàn)出此作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1

6、構(gòu)成的脂筏結(jié)構(gòu)密切參與了巨噬細(xì)胞吞噬攝取oxLDL的過程，而CD36及Caveolin-1的基因沉默均大幅減少了膽固醇在細(xì)胞中的積累，表明CD36在與oxLDL表位結(jié)構(gòu)oxLig-1結(jié)合后，能夠啟動(dòng)Caveolin-1脂筏的形成，并通過此方式介導(dǎo)了oxLDL的吞噬和攝取作用。
　　再次研究了oxLig-1與CD36的結(jié)合作用對(duì)Caveolin-1蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。免疫共沉淀、基因沉默及抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，oxLig

7、-1與CD36結(jié)合作用在啟動(dòng)脂筏形成以及oxLDL吞噬攝取作用的同時(shí)，能夠激活CD36下游Src-JNK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被活化，進(jìn)而上調(diào)了Caveolin-1的蛋白表達(dá)，最終進(jìn)一步加速了Caveolin-1脂筏的形成以及oxLDL的吞噬攝取作用。
　　最后評(píng)價(jià)了LOX-1在巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LOX-1基因沉默明顯增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積作用。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

8、，oxLDL以及oxLig-1的刺激作用可通過濃度和作用時(shí)間依賴的方式上調(diào)ABCA1(ATP bindingcassette transporter A1)的蛋白表達(dá)，而oxLig-1的甲基化修飾和LOX-1蛋白表達(dá)缺失均能夠抑制此上調(diào)作用。進(jìn)一步的報(bào)告基因及抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，oxLDL在啟動(dòng)巨噬細(xì)胞泡沫化的同時(shí)，還可通過其表位配體oxLig-1與LOX-1的結(jié)合作用誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ(Peroxisome prolifer