三種近紅外熒光EMSA實驗方法的建立及應用研究.pdf

1、核因子-кB(NF-кB)是一種誘導性轉錄因子，參與眾多基因的表達調(diào)控，因此與許多疾病密切相關，是目前進行轉錄治療和藥物篩選的一個重要靶點。NF-кB結合位點的鑒定是發(fā)現(xiàn)其靶基因、建立其操縱的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的重要基礎。NF-кB結合位點的鑒定技術可分為干實驗技術和濕實驗技術。干實驗是基于生物信息學的鑒定技術；濕實驗是基于生物實驗的鑒定技術。電泳遷移率變動分析(EMSA)技術是一種低通量的濕實驗技術，數(shù)富集配體系統(tǒng)進化高通量測序技術(SEL

2、EX-Seq)是一種高通量的濕實驗技術。EMSA技術是檢測轉錄因子結合位點的經(jīng)典濕實驗技術之一，不僅能定性分析轉錄因子的活化水平，還能定量檢測解離常數(shù)，驗證高通量檢測結果?，F(xiàn)有的放射性EMSA、化學發(fā)光EMSA和雙色普通熒光EMSA在實際應用中還存在或多或少的缺點，限制了這些實驗技術的日常應用。近年來發(fā)展了運用近紅外熒光素直接標記DNA進行EMSA檢測的近紅外熒光EMSA技術，但該技術目前使用成本非常昂貴，探針的合成及修飾費時麻煩。因此

3、，建立一種檢測效果良好且成本低的NIRF-EMSA新方法非常必要。
　　基于此目的，本論文設計并比較了三種基于Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)的EMSA檢測方法，即：直接掃膠法、凝膠染色法和掃膜法。通過檢測分析HeLa細胞核提取物中轉錄因子NF-кB的活性，發(fā)現(xiàn)掃膜法NIRF-EMSA檢測效果好、靈敏度高、性價比高，可以替代傳統(tǒng)的EMSA技術。掃膜法NIRF-EMSA的主要實驗步驟包括：蛋白與生物素標記DNA的結合反應、反應產(chǎn)物的自

4、然聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠的尼龍膜電轉印、尼龍膜的近紅外熒光標記鏈親合素檢測。該實驗流程綜合了化學發(fā)光EMSA和近紅外熒光檢測的優(yōu)點，在保證檢測靈敏度的前提下，是實驗成本降到最低，從而實現(xiàn)NIRF-EMSA的日?；统杀颈憷麘谩?br>　　本論文應用掃膜法NIRF-EMSA技術可以分析NF-кB與不同DNA序列結合的解離常數(shù)。在掃膜法NIRF-EMSA實驗中，當遷移帶與游離帶亮度相同時，該泳道中蛋白濃度大小與該序列的解離常數(shù)值相等。通

5、過此方法檢測了四條經(jīng)SELEX-Seq篩選得到的DNA序列的解離常數(shù)。分析各序列解離常數(shù)與SELEX-Seq富集條數(shù)之間的相關性，發(fā)現(xiàn)通過掃膜法NIRF-EMSA測得的DNA序列的解離常數(shù)與富集條數(shù)之間呈負相關。證明掃膜法NIRF-EMSA可用于研究轉錄因子蛋白與DNA的相互作用。
　　基于單核苷酸突變雙鏈DNA微陣列芯片獲得的親合性數(shù)據(jù)，本論文還建立了一種單核苷酸突變矩陣(SNMM)模型，用于分析預測NF-кB與不同DNA序列的

6、結合親合性，并運用上述NIRF-EMSA實驗方法，共同評價和分析SELEX-Seq實驗獲得的大量DNA序列的結合親合性，用于鑒定轉錄因子NF-кB的結合位點。結果表明DNA序列的SNMM評分值與SELEX-Seq實驗值呈正相關。通過掃膜法NIRF-EMSA進一步證明SNMM評分值與EMSA實驗值吻合。將SNMM評分值高于最佳閾值的DNA序列作為轉錄因子NF-кB潛在的結合位點，以便進一步從基因組中識別鑒定NF-кB靶基因。
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