化學(xué)發(fā)光及其與毛細(xì)管電泳聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用研究.pdf

1、化學(xué)發(fā)光(CL)是化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)物或生成物吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能，電子由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的光輻射，它不需要任何光源，避免了雜散光的干擾，因此具有極高的靈敏度。由于僅使用較為簡單的儀器設(shè)備，這一方法得到了迅速發(fā)展。目前，化學(xué)發(fā)光分析成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域，已成功地用于生產(chǎn)過程的控制、遙測技術(shù)、環(huán)境污染自動(dòng)檢測網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的建立、生物醫(yī)學(xué)及臨床化學(xué)中各種無機(jī)和有機(jī)化合物的分析、藥物分析和免疫分析等。其最新發(fā)展主要

2、是在原有的發(fā)光試劑及體系的基礎(chǔ)上，建立新的發(fā)光體系。與其它技術(shù)如流動(dòng)注射(FIA)、毛細(xì)管電泳(CE)、高效液相色譜(HPLC)等的聯(lián)用，拓寬了化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用范圍。 毛細(xì)管電泳(CE)是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型分離分析技術(shù)，在20世紀(jì)80年代中后期得到迅速發(fā)展。毛細(xì)管電泳實(shí)際包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，被譽(yù)為繼氣相色譜和液相色譜之后分離科學(xué)的第三次重大變革，使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞

3、，乃至單分子分析成為可能。最富特色的應(yīng)用研究有蛋白質(zhì)分離、糖分析、DNA測序、手性分離、單細(xì)胞分析以及用于分子動(dòng)力學(xué)及疾病早期診斷等，此外金屬離子及小分子有機(jī)化合物的毛細(xì)管電泳分析也備受關(guān)注。毛細(xì)管電泳中窄徑毛細(xì)管的使用，使CE具有很低的質(zhì)量檢出限和僅需要很少的樣品體積等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)窄的內(nèi)徑也給檢測帶來了困難，使其濃度靈敏度很低。最近，靈敏度的限制已成為毛細(xì)管電泳發(fā)展的一大障礙，改善檢測靈敏度也已成為毛細(xì)管電泳一個(gè)十分重要的研究領(lǐng)域。

4、 高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測手段與高選擇性的毛細(xì)管電泳結(jié)合于一體，成為一種理想的分離分析方法，兩種方法能取長補(bǔ)短，充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，非常適合復(fù)雜中草藥有效成分的分析?？梢哉f，毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法的聯(lián)用技術(shù)為現(xiàn)代痕量分析帶來勃勃生機(jī)，開辟了高靈敏分析中草藥中多羥基酚類化合物的新途徑。 本論文首先對已建立的發(fā)光體系靈敏度的改善和新建立的化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測定人體體液和動(dòng)物血液中的一些成分以及

5、四環(huán)素類藥物的方法。其次，為了改善化學(xué)發(fā)光較差的選擇性和毛細(xì)管電泳較低的靈敏度，將兩種技術(shù)聯(lián)用，運(yùn)用自組裝的改進(jìn)后的毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光分析儀，用于分析中草藥中有效成分-多羥基酚類化合物。由于毛細(xì)管很容易再生，毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法成為分析復(fù)雜樣品的一種理想方法。 一、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光1.研究發(fā)現(xiàn)，陽離子表面活性劑CTMAB對魯米諾-鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀體系分析尿酸的含量有很強(qiáng)的增敏作用，并且尿酸的形態(tài)對發(fā)光強(qiáng)度也有很大的影響?；?/p>

6、此，采用流動(dòng)注射技術(shù)，建立了測定人體體液中尿酸含量的方法。該方法的線性范圍和檢出限分別是7.0×10-9-9.0×10-7mol/L，2.58×10-10mol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的其它方法相比，檢出限降低約兩個(gè)數(shù)量級。并詳細(xì)討論了CTMAB對該體系增敏及尿酸的形態(tài)對發(fā)光強(qiáng)度影響的機(jī)理。 2.氯化血紅素的光穩(wěn)定性較差，利用H2O2-Na2CO3-NaOH介質(zhì)，首次使用流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光技術(shù)，對氯化血紅素在強(qiáng)自然光、弱自然光及紫外光作

7、用下分解情況進(jìn)行了研究，分析了光解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化血紅素在不同光作用下的分解反應(yīng)速度不同，但其光解行為符合一級反應(yīng)方程。優(yōu)化反應(yīng)條件后，測定了藥物和動(dòng)物血液中氯化血紅素的含量，線性范圍為2.20×10-10-6.88×10-7mol/L，檢出限(3σ)為2.2×10-11mol/L。對1.72×10-9mol/L的氯化血紅素測定10次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82％。此法直接用于藥物及動(dòng)物血液中氯化血紅素含量的分析，回收率在96

8、-108％之間。 3.堿性條件下，羅丹明B與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生微弱化學(xué)發(fā)光信號，氯化血紅素作為一種過氧化物酶，大大增強(qiáng)了其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)加入處于臨界膠束濃度的陰離子表面活性劑SDS后，其發(fā)光強(qiáng)度又增大了4倍多。同時(shí)對加入SDS和不加入SDS的氯化血紅素樣品在紫外光下的光解行為進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種情況下，氯化血紅素的分解行為均符合一級動(dòng)力學(xué)方程。但是，加入SDS后，由于其形成的膠束相的增穩(wěn)作用，氯化血紅素的光解速度降低了1.8倍。該

9、方法用于測定了藥片及動(dòng)物血液中氯化血紅素的含量。 4.對于四環(huán)素類藥物的化學(xué)發(fā)光分析報(bào)道的方法中，有的方法反應(yīng)比較復(fù)雜，有的方法使用的試劑比較昂貴、不穩(wěn)定或者有毒性。本研究首次使用間接發(fā)光法，以銅離子為探針，利用四環(huán)素類藥物與銅離子形成絡(luò)合物后，減弱了銅離子對魯米諾-過氧化氫體系的催化作用機(jī)理，分析了藥物及其人體尿液中四環(huán)素、土霉素和金霉素的含量。方法的線性范圍分別是四環(huán)素3.6×10-8-1.0×10-5，土霉素1.1×10-

10、7-1.0×10-5，金霉素1.9×10-7-1.0×10-5mol/L。藥物中的賦形劑和尿液中的共存物不干擾測定，方法的回收率為95-105％。 二、毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光1.運(yùn)用改進(jìn)后的毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光儀，以魯米諾為電泳電解質(zhì)的一個(gè)組成部分及以鐵氰化鉀作為唯一柱后液的新型混合模式進(jìn)行丹參的主要成分原兒茶醛和原兒茶酸的毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原兒茶醛和原兒茶酸能增強(qiáng)體系的發(fā)光強(qiáng)度，且發(fā)光強(qiáng)度與其濃度在一定范圍內(nèi)成正比。

11、詳細(xì)研究了影響分離和檢測的參數(shù)，在最佳條件下，6分鐘內(nèi)基線分離了原兒茶醛和原兒茶酸。方法的檢出限分別為7.0×10-8mol/L和5.0×10-8mol/L。利用此方法，分析了丹參片劑和注射液中原兒茶醛和原兒茶酸的含量。對二者增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀體系發(fā)光強(qiáng)度的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)討論。 2.蘆丁和綠原酸均為生理學(xué)上重要的多羥基酚類化合物，也是煙草中的重要成分。本工作將毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離化學(xué)發(fā)光檢測應(yīng)用于蘆丁與綠原酸的分析。CL檢測基于

12、蘆丁或綠原酸對魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系的增敏作用。仔細(xì)研究了分離與檢測的各種參數(shù)后，將此方法用于香煙絲和藥物制劑中蘆丁與綠原酸含量的測定，回收率在97-105％之間。 3.利用SDS作為有機(jī)添加劑，首次報(bào)道了應(yīng)用CE-CL技術(shù)分析蘆丁、原兒茶醛、綠原酸、木犀草素和原兒茶酸5種藥物有效成分。實(shí)驗(yàn)表明，不加入SDS時(shí)，5種分析物不能得到完全分離；SDS加入后，5種分析物在10分鐘內(nèi)得到完全基線分離，且峰形尖銳對稱。分析物峰高的RSD

13、不大于2.6％，遷移時(shí)間的RSD不大于0.5％。將建立的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的測定，回收率在95-105％之間。該方法具有分離效果好、檢測靈敏度高等特點(diǎn)，為復(fù)雜中草藥中有機(jī)小分子的分析開辟了新的途徑。 4.基于在堿性介質(zhì)中葡萄糖苷和黃芩苷對魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用，建立了一種毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離在線間接化學(xué)發(fā)光法檢測中藥有效成分葡萄糖苷和黃芩苷的方法。電泳緩沖液為8.0mmol/L硼砂(pH=8.5)，0.30mmol

14、/L魯米諾作為其中的組分?；瘜W(xué)發(fā)光試劑由0.125mmol/LK3Fe(CN)6和0.05mol/L的NaOH組成。葡萄糖苷和黃芩苷在5分鐘內(nèi)得到基線分離。方法的檢出限分別為60fmol和24fmol。該方法用于雙黃連口服液中黃芩苷的測定，回收率為103.3％。 5-溶液中單分子檢測涉及到化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)、材料等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，對其進(jìn)行研究具有十分重要的意義，目前對有機(jī)小分子的分子級檢測尚未見報(bào)道。我們研究了小分子有機(jī)化合物棉酚的