反芻動物尿中嘌呤衍生物和肌酸苷的高效液相色譜測定方法改進(jìn).pdf

1、反芻動物尿中嘌呤衍生物(PD，purine derivatives)包括尿囊素、尿酸、黃嘌呤和次黃嘌呤，它們被廣泛應(yīng)用估測瘤胃微生物蛋白(MCP)供給。Chen等認(rèn)為動物尿中PD與肌酸苷的比值能作為測定反芻動物MCP的一個指標(biāo)。目前定量測定動物尿中PD和肌酸苷主要有兩種方法：比色法和高效液相色譜法(HPLC)。本研究建立了一種同時測定動物尿中PD和肌酸苷的HPLC方法。 色譜條件：采用Varian Prostar 210型高效液

2、相色譜儀配有Prostar二極管陣列檢測器，Prostar 210色譜泵。以Variau C18柱(5μm，250mm × 4.6mmI.D.)為分析柱，Varian A0495-MG 9771837為保護(hù)柱；以25mmool/l KH2PO4(pH=4.7)為流動相，流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20μl；檢測波長：220nm；柱溫：25℃。實(shí)現(xiàn)了對動物尿樣中PD和肌酸苷的分離與測定。 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配置：尿囊素300μmo

3、l、肌酸酐100gmol標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40ml超純水中；準(zhǔn)確稱取尿酸100μmol.、黃嘌吟50μmol、次黃嘌呤50μmol標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40ml熱堿溶液(pH>10，KOH溶液80℃)，待標(biāo)樣完全溶解，用0.01mol/l KOH和0.01mol/1 H3PO4調(diào)整pH=6：混合上述倆種溶液，用超純水定容100ml，調(diào)整pH=6，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。 由于尿囊素和肌酸苷具有極其相似的分子極性，用HPLC分離動物尿中的這兩種物質(zhì)時

4、，其色譜峰很容易發(fā)生重疊，給測定帶來困難。在本試驗(yàn)條件下，尿中尿囊素和肌酸苷的色譜峰能夠得到有效的分離。標(biāo)準(zhǔn)品中尿囊素、肌酸苷、尿酸、次黃嘌呤和黃嘌呤，其保留時間分別為：2.78，3.43，4.97，6.00，6.73min。標(biāo)準(zhǔn)品中物質(zhì)的濃度和峰面積呈很好的線性相關(guān)，加標(biāo)回收率為96-102％，日內(nèi)日間精密度測定在2.8-4.3％之間；在信噪比S/N=3的條件下，尿囊素、肌酸苷、尿酸、次黃嘌呤和黃嘌呤的最低檢測限分別為0.6μmol/