東北淡水魚低溫特征腐敗菌分析及其群體信號分子檢測研究.pdf

1、群體感應(yīng)現(xiàn)象是指細(xì)菌產(chǎn)生自誘導(dǎo)物或信號分子進(jìn)入環(huán)境中，通過感知細(xì)菌群體密度，從而開啟特定基因的表達(dá)機(jī)制。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的最常見的信號分子為N-?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-L-homoserine lactones，AHLs)。在淡水魚腐敗菌中，AHLs能夠調(diào)節(jié)腐敗菌的濃度，并提高腐敗菌的腐敗能力，加速魚肉的腐敗過程。檢測腐敗菌的AHLs對研究魚肉腐敗有著重要的作用。
　　本文以魚肉腐敗過程中特征腐敗菌產(chǎn)AHLs的含量變

2、化為研究對象，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)從東北淡水魚中篩選出在低溫條件下魚肉到達(dá)腐敗點(diǎn)時的特征腐敗菌;通過熒光染色、流式測定及透射電鏡等方法確定AHLs能夠誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生特異性反應(yīng);通過海藻酸鈉和氧化石墨烯形成生物相容性材料成功構(gòu)建傳感模型，將其與肥大細(xì)胞電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合對3種AHLs標(biāo)品進(jìn)行快速檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;同時模擬魚肉腐敗過程，對腐敗魚肉中的AHLs進(jìn)行檢測。為淡水魚腐敗過程中AHLs檢測提供新的理論和依據(jù)，為AHLs的常

3、規(guī)檢測提供了一種新型的、精確的檢測方法。本文主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1.以東北三種淡水魚—鳙魚、鯽魚和鯉魚為研究對象，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究4℃冷藏過程中淡水魚的菌群多樣性變化。對新鮮點(diǎn)和腐敗點(diǎn)的三種淡水魚進(jìn)行總DNA提取，通過對16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析，并對圖譜中的優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠測序。結(jié)果表明，三種淡水魚在貯藏期間條帶變化明顯。新鮮點(diǎn)時，淡水魚菌群以氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿

4、菌屬、希瓦氏菌屬、不動桿菌屬和乳球菌屬為主;腐敗點(diǎn)時，假單胞菌屬、腐敗希瓦氏菌屬、芽單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬。
　　2.生長良好的肥大細(xì)胞經(jīng)3種不同的AHLs刺激，通過熒光觀察、流式測定及透射電鏡掃描細(xì)胞形態(tài)來初步判定AHLs對肥大細(xì)胞的影響。熒光觀察結(jié)果表明，3種AHLs都一定程度上對肥大細(xì)胞有著調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，3中AHLs對肥大細(xì)胞的凋亡率在17～20％左右，其中3OC12-HSL效果最強(qiáng);透射電鏡

5、圖像也證明了3種AHLs能使肥大細(xì)胞脫顆粒，使細(xì)胞核消融。
　　3.同時制備氧化石墨烯，將其與海藻酸鈉混合，優(yōu)化比例制成凝膠，通過FT-IR和XRD檢測兩者的相容性，并將肥大細(xì)胞固定在凝膠中，建立肥大細(xì)胞傳感模型。以RBL-2H3肥大細(xì)胞作為傳感介質(zhì)，利用海藻酸鈉與氧化石墨烯混合制成的凝膠將肥大細(xì)胞固定于金電極表面，用該肥大細(xì)胞傳感器對不同細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行檢測，選取最優(yōu)細(xì)胞數(shù)，然后對3種AHLs的標(biāo)準(zhǔn)物的不同濃度進(jìn)行了檢測，以電化

6、學(xué)阻抗作為指標(biāo)，建立了阻抗值與AHLs濃度之間的線性關(guān)系。經(jīng)FT-IR和XRD檢測，比例優(yōu)化后的氧化石墨烯和海藻酸鈉相容性很好，肥大細(xì)胞被成功的固定在凝膠中。通過電化學(xué)傳感優(yōu)化出凝膠中GO的最佳比例為10％，此時凝膠具有良好的導(dǎo)電性和塑性。通過電化學(xué)傳感器發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞數(shù)與所測得的阻抗值有著線性關(guān)系，其線性方程為y=309.636x+354.711，R2=0.994。肥大細(xì)胞經(jīng)不同濃度的3OC12-HSL刺激后，隨著3OC12-HSL濃

7、度越大，所測得的阻抗值越小，且兩者在一定濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，其線性方程為y=-1339.252x+3580.906R2=0.994。而經(jīng)不同濃度的C4-HSL和C6-HSL刺激后，C4-HS和C6-HSL濃度越大，所測得阻抗值越小，兩者無線性關(guān)系。
　　4.選取假單胞菌和腐敗希瓦氏菌這兩株具有代表性的特征腐敗菌，分別接入無菌魚汁中，在不同時間進(jìn)行AHLs的粗提取，經(jīng)過肥大細(xì)胞電化學(xué)傳感器測定后發(fā)現(xiàn)，在0～6天內(nèi)兩種菌產(chǎn)生的AHL